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NaHCO3胁迫对草鱼鳃和肝胰脏组织抗氧化酶与组织结构的影响  PDF

  • 陈立伟 1
  • 姜雨辰 1
  • 贾学文 1
  • 李家乐 1,2
  • 邱军强 1,2
  • 沈玉帮 1,2
1. 上海海洋大学 农业农村部淡水水产种质资源重点实验室,上海 201306; 2. 上海海洋大学 上海水产养殖工程技术研究中心,上海 201306

中图分类号: S 917.4

最近更新:2024-09-04

DOI: 10.12024/jsou.20240504546

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摘要

为了探究NaHCO3胁迫对草鱼鳃和肝胰脏组织抗氧化酶和组织结构的影响,采用3个NaHCO3浓度组(10, 20, 30 mmol/L)对草鱼进行NaHCO3胁迫,对鳃和肝胰脏组织进行抗氧化酶(SOD、CAT)酶活性测定和组织病理学观察。结果显示,草鱼在NaHCO3胁迫下,鳃组织SOD、CAT酶和肝胰脏组织CAT酶在72 h内活力变化总体上呈先上升后下降的趋势,仅肝胰脏组织SOD酶在72 h内活力总体呈上升趋势,且各实验组中,两组织的抗氧化酶活力相比空白组具有显著差异;相比空白组,实验组的草鱼鳃组织中,鳃丝翻折和褶皱情况严重、扁平上皮细胞PVC严重脱落、线粒体富集细胞MRC肿胀;在肝胰脏组织中,胰脏细胞肿胀、细胞间隙增大、肝细胞核偏移和空泡化减少。研究表明,NaHCO3胁迫会影响草鱼抗氧化水平,并且对草鱼鳃和肝胰脏组织产生组织损伤,随着浓度增大损伤程度加重。本研究可为盐碱水域草鱼的养殖与推广应用提供参考资料。

我国约有0.46亿hm2的低洼盐碱水域,遍及19个省市和自治

1。盐碱水作为分布于陆地区域的非海洋性咸水资源,具有高碱度、高pH、离子组成复杂等特点,在利用方面存在一定的难2

碱度是指水体中溶解的碳酸根离子、氢氧根离子和碳酸氢根离子的总和,通常以pH来表示,而盐碱水中的碱度主要成分是HCO3-和CO32-。适当的碱度有助于维持水体中鱼类生长所需的酶活性和代谢功能,但是过高或者过低的碱度影响鱼类的生长和发育。研

3认为,过高碱度会损伤鳃组织并对离子交换体系和Na+-K+-ATP酶主动调节功能造成影响。碱盐胁迫(NaHCO3和Na2CO3)对生物的破坏性大于中性盐胁迫(NaCl和Na2SO44

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国产量最高的淡水养殖鱼类,是我国四大家鱼之一,分布广

5-6。由于盐碱水高pH、高碳酸盐碱度且离子比例失衡,在碱胁迫下刺激鱼体造成的应激性疾病和死亡在水产养殖中经常发7。近年来,随着国内外学者对鱼类耐盐碱的生理和分子机制研究的深入,越来越多与鱼类耐盐碱性能相关的生理指标、分子标记及基因被鉴定和利8。国外学者在早期对钩吻鳟(Oncorhynchus clarki henshawi9、卡拉白鱼(Chalcalburnus tarichi10和裸鲤(Gymnocypris przewalskii11等具有耐盐碱能力鱼类进行了一定的研究,近年来我国学者也对鲫 (Carassius auratus12、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus13、鲤(Cyprinus carpio14、青鳉(Oryzias latipes15和乌苏里白鲑(Coregonus ussuriensis16等鱼类开展了一些碱胁迫下的分子和生理机制相关研究,这对于盐碱水域开展增养殖具有重要意义。本研究以草鱼为研究对象,对不同NaHCO3浓度下的草鱼鳃和肝胰脏组织进行胁迫,通过抗氧化酶活性测定和组织病理学观察探究草鱼在NaHCO3胁迫下生理生化变化,为草鱼在盐碱水中养殖提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验在苏州市申航生态科技发展股份有限公司进行,所使用的实验用鱼为同批孵化并培育约90 d的健康草鱼,平均体质量为(91.31±3.12) g,体长为(13.67±1.43) cm。胁迫实验在100 cm×80 cm×50 cm 白色硬质塑料箱中进行,采用NaHCO3(分析纯,国药沪试)与曝气处理后的自来水来配制不同浓度的试验用水,稳定24 h后,通过酸碱滴定法测定并调整浓度。

1.2 试验方法

根据预试验草鱼NaHCO3最大耐受浓度为37 mmol/L

17,分别设置3个NaHCO3浓度梯度(10 mmol/L、20 mmol/L和30 mmol/L)和1个空白对照组(0 mmol/L),4个实验组均设置3个平行重复,其结果取平均值。试验前,所有草鱼均在曝气过的自来水中暂养7 d,每个浓度组及其平行重复都随机放入40尾草鱼,试验期间每天换水,换水量为总水体的三分之一,所换水体为配置对应浓度后稳定24 h后的水。试验前7天不投喂,每天观察水质情况并及时捞出死鱼。

1.3 样本采集及检测

1.3.1 样本采集

试验开始于早上8时30分,在试验开始后的第2、4、6、12、24、48、72小时分别采集不同浓度组与空白组草鱼及其平行重复各3尾的鳃和肝胰脏组织样本,随即使用液氮冷冻保存于-80 ℃冰箱内,用于后续酶活力测定。在第72小时,同时采集样本置于4 %多聚甲醛溶液中,固定24 h后用于进行切片制作。

1.3.2 草鱼鳃和肝胰脏组织酶活测定

取0.1 g左右样品在冰水浴条件下按1∶9的比例与PBS缓冲液制成匀浆,2 500 r/min 10 min离心后制成匀浆上清,使用SOD、CAT酶活试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行酶活力测定,使用GraphPad Prism 9 软件记录数据并制图,实验数据采用two-way方差分析(ANOVA),结果采用平均值±标准差(Mean±SE)表示,P<0.05为显著性差异。

1.3.3 草鱼鳃和肝胰脏组织病理学观察

在第72小时采集的样品经多聚甲醛溶液固定24 h后,使用70%乙醇溶液进行洗涤并保存。固定好的组织进行石蜡包埋,使用切片机制成5 µm横切切片,经H.E染色后用中性树脂封片,使用Nikon光学显微镜观察,拍照。

2 结果

2.1 NaHCO3胁迫对草鱼组织抗氧化酶活力的影响

不同浓度组草鱼鳃组织SOD活力随时间变化呈现先升高后下降的情况。在30 mmol/L浓度下,鳃组织SOD酶活力在12 h时达到最高,随后开始下降;在20 mmol/L浓度下,鳃组织SOD酶活力在12 h达到最高值,随后开始下降,在72 h时酶活力小幅上升;在10 mmol/L浓度下,鳃组织SOD酶活力在12 h达到最高值,随后缓慢下降。在6、12和24 h时, 30 mmol/L浓度组鳃组织SOD酶活力相比其他组存在明显差异。在72 h时,20 mmol/L浓度下鳃组织SOD酶活力相比其他组存在明显差异,见图1

图1  草鱼鳃和肝胰脏组织在NaHCO3胁迫下的抗氧化酶活性

Fig.1  Activity of antioxidant enzymes in gill and hepatopancreas tissues of grass carp under NaHCO3 stress

(a),(b)为草鱼鳃和肝胰脏组织SOD活性在72 h内变化图,(c),(d)为草鱼鳃和肝胰脏组织CAT活性在72 h内变化图。不同小写字母上标表示该时间段内显著差异(P<0.05)。

(a),(b) are the SOD activity changes in gill and hepatopancreas tissues of grass carp within 72 h; (c),(d) are the CAT activity changes in gill and hepatopancreas tissues of grass carp within 72 h. Different lowercase superscripts indicate significant differences in the time period (P < 0.05).

不同浓度草鱼肝胰脏组织SOD活力随时间变化总体上呈升高的情况,在30 mmol/L浓度下,肝胰脏组织SOD酶活力在6 h时出现下降,并在24 h时开始上升,在72 h时SOD酶活力达到最高;在20 mmol/L浓度下,肝胰脏组织SOD酶活力仅在6和24 h时出现下降,酶活力峰值出现在72 h;在10 mmol/L浓度下,肝胰脏SOD酶活力24 h时出现下降,随后继续上升,SOD酶活力峰值出现在72 h。在4,12和24 h,20 mmol/L浓度组的肝胰脏组织SOD酶活力相比其他组存在显著差异,在2 h时30 mmol/L浓度下肝胰脏组织的SOD酶活力显著高于其他组,见图1

不同浓度组的草鱼鳃组织CAT活力随时间变化总体呈现出先上升后下降的水平,在30 mmol/L浓度下,鳃组织CAT酶活力在12 h达到最高值,随后开始下降,但在72 h时CAT酶活力上升。在20 mmol/L浓度下,鳃组织CAT酶活力峰值出现在12 h,随后开始下降,在72 h恢复至初始水平;在10 mmol/L浓度下,鳃组织CAT酶活力峰值出现在12 h,随后开始下降并在72 h时恢复至初始水平;30 mmol/L浓度组鳃组织CAT活力相比其他组存在显著差异,见图1

不同浓度组草鱼肝胰脏组织CAT酶活力变化随时间变化总体呈先上升后下降的趋势。在30 mmol/L浓度胁迫下,肝胰脏组织CAT酶活力峰值出现在2 h,随后开始下降,除24和48 h时上升,在72 h肝胰脏组织CAT酶活力达到最低值并小于空白组初始水平;在20 mmol/L浓度下,肝胰脏组织CAT酶活力峰值出现在2 h,随后开始下降,在72 h时恢复至初始水平;在10 mmol/L浓度下,肝胰脏组织CAT酶活力在2 h达到最高值,随后开始下降,在12 h时下降到初始水平,之后继续下降,在72 h时CAT酶活力明显低于初始水平。在4,6和12 h时20 mmol/L浓度组肝胰脏组织CAT酶活力相比其他组差异更为显著,见图1

2.2 NaHCO3胁迫对草鱼组织结构的影响

2.2.1 草鱼鳃组织形态结构变化

根据组织病理学观察,空白组鳃组织结构完整,鳃小片(GL)对称,扁平上皮细胞(PVC)紧密贴合在鳃小片上,线粒体富集细胞(MRC)均匀分布在鳃丝两侧;10 mmol/L NaHCO3胁迫下的鳃组织鳃丝(GF)变得褶皱、鳃小片变长、PVC发生脱水并且MRC减少;20 mmol/L NaHCO3胁迫下鳃小片弯曲且末端出现增生、PVC和MRC脱落情况加剧;30 mmol/L 浓度时鳃小片缩短、PVC严重脱落,MRC肿胀,见图版Ⅰ。

图版 Ⅰ  不同浓度NaHCO3胁迫72 h草鱼鳃组织的显微结构

Plate Ⅰ   Microstructure of gill tissue of grass carp under different NaHCO3 stress for 72 h

1.空白组;2.10 mmol/L组;3.20 mmol/L组;4.30 mmol/L组;GF.鳃丝;GL.鳃小片;PVC.扁平上皮细胞;MRC.线粒体富集细胞。

1.Blank group; 2.10 mmol/L group; 3.20 mmol/L group; 4.30 mmol/L group; GF.Gill filament; GL.Gill lamellae; PVC.Pavement cell; MRC.Mitochondria rich cells.

2.2.2 草鱼肝胰脏组织结构形态变化

根据组织病理学观察,空白组的肝胰脏结构清晰,肝板排列规则,肝细胞核居中,在空白组肝胰脏组织中有脂肪空泡,但在其他3个浓度组中没有发现明显脂肪空泡现象;10 mmol/L浓度组中肝窦隙增多,肝细胞核发生偏移;20 mmol/L浓度组肝细胞核偏移,肝窦隙增大,胰脏之间空隙增大;30 mmol/L浓度组肝细胞间隙继续增大,胰脏受到损伤,形状不均匀,中央静脉边缘有部分胰腺细胞融入,见图版Ⅱ

图版 Ⅱ  不同浓度NaHCO3胁迫72 h 草鱼肝胰脏组织的显微结构

PlateⅡ  Microstructure of hepatopancreas tissue of grass carp under different NaHCO3 stress for 72 h

1.空白组;2.10 mmol/L组;3.20 mmol/L组;4.30 mmol/L组;CV.中央静脉;HP.肝板;N.细胞核;HS.肝血窦;S.肝窦隙;BC.血细胞; PC.胰腺细胞。

图版 Ⅱ 不同浓度NaHCO3胁迫72 h草鱼肝胰脏组织的显微结构

1.Blank group; 2.10 mmol/L group; 3.20 mmol/L group; 4.30 mmol/L group; CV.Central vein; HP.Hepatic plate; N.Nucleus; V.Vacuolar; HS.Hepatic sinusoid; S.Sinusoid; BC.Blood cells; PC.Pancrea cells.

3 讨论

3.1 NaHCO3胁迫对草鱼鳃和肝胰脏组织的氧化应激

SOD通过歧化反应高效催化超氧化物阴离子(O2-),将其转化为H2O2和O2,CAT可以将其代谢为无毒无害的水(H2O),保护机体不受过氧自由基造成的损

18。研究发现,氨氮暴露后异育银鲫 (Carassius auratus gibelio) SOD的活性出现显著性升高,表明SOD在清除ROS和缓解氧化损伤方面发挥了重要作19。乌苏里白鲑在NaHCO3胁迫下CAT活性升高来保护自身不受氧化损伤,且SOD和CAT酶在应对NaHCO3胁迫时相互协调共同作16。本研究结果显示,草鱼在NaHCO3胁迫下鳃和肝胰脏组织都发生了氧化应激,并且在肝胰脏中抗氧化酶活力更高。有学者发现篮子鱼(Siganus guttatus )CAT的活力以肝脏中最20,这一结论与本研究的结果一致。在本研究中同样发现,在10和20 mmol/L浓度下草鱼鳃和肝胰脏组织CAT酶活性随着时间的推移,72 h后大致能恢复到正常水平。说明草鱼在低浓度NaHCO3环境中能通过机体自身的抗氧化调节机制来适应。而在30 mmol/L浓度条件下,两组织抗氧化酶活性胁迫72 h时仍未恢复到正常水平,说明高浓度NaHCO3环境可能会影响机体抗氧化调节机制适应时间,有待进一步探究。

3.2 NaHCO3胁迫对草鱼鳃和肝胰脏组织的结构影响

鳃是鱼类进行呼吸和排除代谢废物的主要器官,鱼类通过鳃组织摄取氧气和排出二氧化碳。过高的NaHCO3浓度会对鳃组织造成损伤,影响其气体交换功

17。有研究发现大鳞鲃(Luciobarbus capito)在NaHCO3胁迫下出现鳃丝肿胀、卷曲,MRC增大,PVC脱21。也有一些耐盐碱鱼类在胁迫下发生了适应性变化,例如青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)鳃组织形态结构发生了改变以适应盐碱水造成的低氧环22-24 ,瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)在高浓度NaHCO3胁迫下为了保持鳃的完整结构性和正常生理功能,鳃丝变宽、鳃小片变长、鳃小片间距变25。本研究发现,草鱼在NaHCO3胁迫开始时为适应环境, PVC开始脱水,MRC出现脱落,导致鳃小片变长,尖端收缩变小,使得比表面积增大,这在一定程度上增加水体与鳃丝的接触面积,利于鳃组织与外界环境离子交换和溶氧获取。随着浓度升高, PVC脱水严重导致脱落、坏死,鳃小片变短且厚度变薄,从而减小鳃丝与碱度水体的接触面积。不同浓度鳃组织鳃丝结构匀称到鳃丝变得细长,鳃丝间距增大,再到鳃丝严重翻折和褶皱。说明鳃丝在结构上的改变可能是草鱼对NaHCO3环境的一个生理适应过程。

肝脏是鱼类体内代谢与氧化还原的主要器官,承担着各项代谢、解毒与免疫等重要功能。肝脏作为一个极敏感的器官,也是鱼类进行物质代谢的重要枢纽,外源异生物质主要在肝中进行生物转

26。并且有研究发现肝细胞内的物质合成速度与内循环系统的释放速度失衡会导致细胞空泡27。在本研究中,通过组织病理学观察发现,随NaHCO3浓度升高,胰腺细胞表现出明显的细胞肿胀和细胞间隙扩展,这种组织损伤可能是由于胰腺细胞在NaHCO3下发生的细胞膜损伤和结构不稳定所致。胰腺作为重要的内分泌和外分泌器官,其功能受损可能会触发全身性的免疫反应,导致炎症介质的释放和免疫细胞的活化。这种免疫反应可能对胰腺的进一步损伤起到加剧作用,同时也可能是鱼类对抗胁迫的一种防御机制。空泡化现象仅在空白组中出现,推测NaHCO3胁迫可能对草鱼脂质代谢产生了影响。同时肝细胞的损伤可能与Na、OH-、NH3等物质在肝脏的代谢密切相关,NaHCO3胁迫造成肝脏损伤可能会降低草鱼肝脏清除体内有害代谢产物的能力。

综上,本实验通过对草鱼进行NaHCO3胁迫,利用酶活测定、组织病理学方法对草鱼鳃和肝组织的生理生化指标进行分析,发现草鱼在NaHCO3胁迫下产生氧化应激,在短期内影响了抗氧化酶水平,且鳃和肝组织在胁迫下都受到组织损伤。本实验可以为草鱼在盐碱水养殖和开展草鱼耐盐碱育种提供一定参考。

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