摘要
为了探究NaHCO3胁迫对草鱼鳃和肝胰脏组织抗氧化酶和组织结构的影响,采用3个NaHCO3浓度组(10, 20, 30 mmol/L)对草鱼进行NaHCO3胁迫,对鳃和肝胰脏组织进行抗氧化酶(SOD、CAT)酶活性测定和组织病理学观察。结果显示,草鱼在NaHCO3胁迫下,鳃组织SOD、CAT酶和肝胰脏组织CAT酶在72 h内活力变化总体上呈先上升后下降的趋势,仅肝胰脏组织SOD酶在72 h内活力总体呈上升趋势,且各实验组中,两组织的抗氧化酶活力相比空白组具有显著差异;相比空白组,实验组的草鱼鳃组织中,鳃丝翻折和褶皱情况严重、扁平上皮细胞PVC严重脱落、线粒体富集细胞MRC肿胀;在肝胰脏组织中,胰脏细胞肿胀、细胞间隙增大、肝细胞核偏移和空泡化减少。研究表明,NaHCO3胁迫会影响草鱼抗氧化水平,并且对草鱼鳃和肝胰脏组织产生组织损伤,随着浓度增大损伤程度加重。本研究可为盐碱水域草鱼的养殖与推广应用提供参考资料。
我国约有0.46亿h
碱度是指水体中溶解的碳酸根离子、氢氧根离子和碳酸氢根离子的总和,通常以pH来表示,而盐碱水中的碱度主要成分是HCO
草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国产量最高的淡水养殖鱼类,是我国四大家鱼之一,分布广
本试验在苏州市申航生态科技发展股份有限公司进行,所使用的实验用鱼为同批孵化并培育约90 d的健康草鱼,平均体质量为(91.31±3.12) g,体长为(13.67±1.43) cm。胁迫实验在100 cm×80 cm×50 cm 白色硬质塑料箱中进行,采用NaHCO3(分析纯,国药沪试)与曝气处理后的自来水来配制不同浓度的试验用水,稳定24 h后,通过酸碱滴定法测定并调整浓度。
根据预试验草鱼NaHCO3最大耐受浓度为37 mmol/
试验开始于早上8时30分,在试验开始后的第2、4、6、12、24、48、72小时分别采集不同浓度组与空白组草鱼及其平行重复各3尾的鳃和肝胰脏组织样本,随即使用液氮冷冻保存于-80 ℃冰箱内,用于后续酶活力测定。在第72小时,同时采集样本置于4 %多聚甲醛溶液中,固定24 h后用于进行切片制作。
取0.1 g左右样品在冰水浴条件下按1∶9的比例与PBS缓冲液制成匀浆,2 500 r/min 10 min离心后制成匀浆上清,使用SOD、CAT酶活试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行酶活力测定,使用GraphPad Prism 9 软件记录数据并制图,实验数据采用two-way方差分析(ANOVA),结果采用平均值±标准差(Mean±SE)表示,P<0.05为显著性差异。
不同浓度组草鱼鳃组织SOD活力随时间变化呈现先升高后下降的情况。在30 mmol/L浓度下,鳃组织SOD酶活力在12 h时达到最高,随后开始下降;在20 mmol/L浓度下,鳃组织SOD酶活力在12 h达到最高值,随后开始下降,在72 h时酶活力小幅上升;在10 mmol/L浓度下,鳃组织SOD酶活力在12 h达到最高值,随后缓慢下降。在6、12和24 h时, 30 mmol/L浓度组鳃组织SOD酶活力相比其他组存在明显差异。在72 h时,20 mmol/L浓度下鳃组织SOD酶活力相比其他组存在明显差异,见
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图1 草鱼鳃和肝胰脏组织在NaHCO3胁迫下的抗氧化酶活性
Fig.1 Activity of antioxidant enzymes in gill and hepatopancreas tissues of grass carp under NaHCO3 stress
(a),(b)为草鱼鳃和肝胰脏组织SOD活性在72 h内变化图,(c),(d)为草鱼鳃和肝胰脏组织CAT活性在72 h内变化图。不同小写字母上标表示该时间段内显著差异(P<0.05)。
(a),(b) are the SOD activity changes in gill and hepatopancreas tissues of grass carp within 72 h; (c),(d) are the CAT activity changes in gill and hepatopancreas tissues of grass carp within 72 h. Different lowercase superscripts indicate significant differences in the time period (P < 0.05).
不同浓度草鱼肝胰脏组织SOD活力随时间变化总体上呈升高的情况,在30 mmol/L浓度下,肝胰脏组织SOD酶活力在6 h时出现下降,并在24 h时开始上升,在72 h时SOD酶活力达到最高;在20 mmol/L浓度下,肝胰脏组织SOD酶活力仅在6和24 h时出现下降,酶活力峰值出现在72 h;在10 mmol/L浓度下,肝胰脏SOD酶活力24 h时出现下降,随后继续上升,SOD酶活力峰值出现在72 h。在4,12和24 h,20 mmol/L浓度组的肝胰脏组织SOD酶活力相比其他组存在显著差异,在2 h时30 mmol/L浓度下肝胰脏组织的SOD酶活力显著高于其他组,见
不同浓度组的草鱼鳃组织CAT活力随时间变化总体呈现出先上升后下降的水平,在30 mmol/L浓度下,鳃组织CAT酶活力在12 h达到最高值,随后开始下降,但在72 h时CAT酶活力上升。在20 mmol/L浓度下,鳃组织CAT酶活力峰值出现在12 h,随后开始下降,在72 h恢复至初始水平;在10 mmol/L浓度下,鳃组织CAT酶活力峰值出现在12 h,随后开始下降并在72 h时恢复至初始水平;30 mmol/L浓度组鳃组织CAT活力相比其他组存在显著差异,见
不同浓度组草鱼肝胰脏组织CAT酶活力变化随时间变化总体呈先上升后下降的趋势。在30 mmol/L浓度胁迫下,肝胰脏组织CAT酶活力峰值出现在2 h,随后开始下降,除24和48 h时上升,在72 h肝胰脏组织CAT酶活力达到最低值并小于空白组初始水平;在20 mmol/L浓度下,肝胰脏组织CAT酶活力峰值出现在2 h,随后开始下降,在72 h时恢复至初始水平;在10 mmol/L浓度下,肝胰脏组织CAT酶活力在2 h达到最高值,随后开始下降,在12 h时下降到初始水平,之后继续下降,在72 h时CAT酶活力明显低于初始水平。在4,6和12 h时20 mmol/L浓度组肝胰脏组织CAT酶活力相比其他组差异更为显著,见
根据组织病理学观察,空白组鳃组织结构完整,鳃小片(GL)对称,扁平上皮细胞(PVC)紧密贴合在鳃小片上,线粒体富集细胞(MRC)均匀分布在鳃丝两侧;10 mmol/L NaHCO3胁迫下的鳃组织鳃丝(GF)变得褶皱、鳃小片变长、PVC发生脱水并且MRC减少;20 mmol/L NaHCO3胁迫下鳃小片弯曲且末端出现增生、PVC和MRC脱落情况加剧;30 mmol/L 浓度时鳃小片缩短、PVC严重脱落,MRC肿胀,见图版Ⅰ。
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图版 Ⅰ 不同浓度NaHCO3胁迫72 h草鱼鳃组织的显微结构
Plate Ⅰ Microstructure of gill tissue of grass carp under different NaHCO3 stress for 72 h
1.空白组;2.10 mmol/L组;3.20 mmol/L组;4.30 mmol/L组;GF.鳃丝;GL.鳃小片;PVC.扁平上皮细胞;MRC.线粒体富集细胞。
1.Blank group; 2.10 mmol/L group; 3.20 mmol/L group; 4.30 mmol/L group; GF.Gill filament; GL.Gill lamellae; PVC.Pavement cell; MRC.Mitochondria rich cells.
根据组织病理学观察,空白组的肝胰脏结构清晰,肝板排列规则,肝细胞核居中,在空白组肝胰脏组织中有脂肪空泡,但在其他3个浓度组中没有发现明显脂肪空泡现象;10 mmol/L浓度组中肝窦隙增多,肝细胞核发生偏移;20 mmol/L浓度组肝细胞核偏移,肝窦隙增大,胰脏之间空隙增大;30 mmol/L浓度组肝细胞间隙继续增大,胰脏受到损伤,形状不均匀,中央静脉边缘有部分胰腺细胞融入,见
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图版 Ⅱ 不同浓度NaHCO3胁迫72 h 草鱼肝胰脏组织的显微结构
PlateⅡ Microstructure of hepatopancreas tissue of grass carp under different NaHCO3 stress for 72 h
1.空白组;2.10 mmol/L组;3.20 mmol/L组;4.30 mmol/L组;CV.中央静脉;HP.肝板;N.细胞核;HS.肝血窦;S.肝窦隙;BC.血细胞; PC.胰腺细胞。
;图版 Ⅱ 不同浓度NaHCO3胁迫72 h草鱼肝胰脏组织的显微结构
1.Blank group; 2.10 mmol/L group; 3.20 mmol/L group; 4.30 mmol/L group; CV.Central vein; HP.Hepatic plate; N.Nucleus; V.Vacuolar; HS.Hepatic sinusoid; S.Sinusoid; BC.Blood cells; PC.Pancrea cells.
SOD通过歧化反应高效催化超氧化物阴离子(
鳃是鱼类进行呼吸和排除代谢废物的主要器官,鱼类通过鳃组织摄取氧气和排出二氧化碳。过高的NaHCO3浓度会对鳃组织造成损伤,影响其气体交换功
肝脏是鱼类体内代谢与氧化还原的主要器官,承担着各项代谢、解毒与免疫等重要功能。肝脏作为一个极敏感的器官,也是鱼类进行物质代谢的重要枢纽,外源异生物质主要在肝中进行生物转
综上,本实验通过对草鱼进行NaHCO3胁迫,利用酶活测定、组织病理学方法对草鱼鳃和肝组织的生理生化指标进行分析,发现草鱼在NaHCO3胁迫下产生氧化应激,在短期内影响了抗氧化酶水平,且鳃和肝组织在胁迫下都受到组织损伤。本实验可以为草鱼在盐碱水养殖和开展草鱼耐盐碱育种提供一定参考。
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