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aldh3a2a敲除对斑马鱼体色的影响  PDF

  • 卢培钰 1,2
  • 冯毅栋 1,2
  • 鲍宝龙 1,2
1. 上海海洋大学 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海 201306; 2. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306

中图分类号: S 917

最近更新:2024-03-18

DOI: 10.12024/jsou.20231204372

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摘要

本研究探究了aldh3a2a在斑马鱼色素细胞发育中的意义及其对醛代谢和肝脏健康的影响。利用 CRISPR/ Cas9技术,成功构建aldh3a2a敲除纯合突变家系,导致黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞数量减少,csf1rapnp4aitk下调,黑色素合成通路关键基因mitfatyrp1bkita下调。转录组分析揭示了基因表达谱系的变化,差异基因scdlplaaox5在类固醇生物合成途径中下调,指示aldh3a2a对类固醇生物合成的关键作用。对视黄醇代谢通路的转录组分析和qpcr联合研究结果表明,aldh3a2a可以调控raldh2、rxrab以及aox5,表明其对视黄酸受体的信号传导有一定影响,同时aldh3a2a可以调控钾离子通道蛋白kcns3b,指示其对色素细胞的影响与钾离子信号传导有关。GO和KEGG富集分析发现突变体的细胞周期、同源重组、RNA 降解、RNA转运、p53信号通路、真核生物核糖体生物发生、DNA复制、碱基切除修复、氨基酰基-tRNA生物合成、细胞质 DNA 传感通路、类固醇生物合成、错配修复、类固醇激素生物合成和醛酸盐代谢等通路也有着广泛影响。此外,aldh3a2a基因敲除会导致体内醛积累明显,产生细胞毒性进而引发肝脏体积异常增大、肝脏内出现空泡,体质量增加的表征,类似于Sjögren-Larsson综合征的症状,揭示了aldh3a2a在斑马鱼体内的作用及其与人类遗传疾病的相关性,将有助于更深入地了解其在斑马鱼和人类中的功能和潜在的治疗靶点。

鱼类体色多种多样,其影响因素主要包含遗传、内分泌、环境和食物

1。不同鱼类在体色形成上的差异与其生活在不同深度时光照强度相关,这是其在环境中长时间适应和演化的结果。已有研究表明,在牙鲆中蓝光能通过感蓝光视蛋白基因sws2介导影响视黄酸合成继而调控黑色素细胞形2,感长波视锥视蛋白opn1lw2基因的缺失会影响视黄醛脱氢酶基因raldh3的表3,且敲除斑马鱼感短波视锥视蛋白sws1基因后,斑马鱼皮肤中另一个视黄醛脱氢酶raldh2的表达量显著降4,综上可知皮肤中的视蛋白通过影响斑马鱼体内视黄酸的代谢,进而影响斑马鱼的体色。

Aldh家族在斑马鱼色素细胞发育中起着关键作用,Aldh1利用视黄醛作为底物,其代谢产物视黄酸具有激活下游基因转录的能

5,通过视黄酸与由视黄酸受体RXR和RAR组成的转录因子复合物结合而发6-7,最终诱导比目鱼和斑马鱼的黑色素细胞发育。但是,在硬骨鱼中不存在aldh1a1,只有aldh1a2和aldh1a3作为该亚群的代表,另一方面,aldh2和aldh5利用甲醛和乙醛作为各自的底物进行线粒体代谢,从而为斑马鱼黑色素细胞的成熟提供必要的原8。在斑马鱼基因组中,aldh3基因表现出显著的多样性,包括5个不同的亚型:aldh3a1、aldh3a2aaldh3a2baldh3b1和aldh3b2,aldh3的主要底物包括长链脂肪9,另外,文献表明其将视黄醛转化为视黄酸并非是其主要功能。在本研究中,我们阐明了aldh3a2a对斑马鱼色素细胞的影响,特别是aldh3a2a在这一生物学过程中所起的作用。

醛是癌细胞中氧化磷酸化和核苷酸合成增强的副产物,这些醛是由脂质过氧化物产生的,这是一种caspase非依赖性的细胞凋亡形式。醛的积累可引起DNA损伤、脂肪变性和肝坏

10,而aldh3a2被认为具有氧化长链脂肪醛的能力,从而减轻对细胞的氧化损9。小鼠中aldh3a2的缺失导致细胞氧化还原状态的改变并影响脂质代谢。在人类中,同源基因aldh3a2a的突变导致Sjögren-Larsson综合征(SLS)。SLS患者具有典型的临床特征,包括鱼鳞病、痉挛性双瘫、智力残疾、癫痫发作和明显的视网膜病10-11aldh3a2中SLS相关突变超过70个,包括氨基酸替换、缺失、插入和剪接错误。在本研究中,我们以斑马鱼为模型系统进行CRISPR/cas9介导的aldh3a2a基因敲除,与转录组测序方法相结合,使我们能够研究由aldh3a2a介导的肝脏毒理学表型,并探索斑马鱼体色形成的机制。

1 材料与方法

1.1 斑马鱼养护

实验所用到的AB系野生型斑马鱼,饲养于上海海洋大学本实验室。斑马鱼的饲养光周期是14 h光照∶10 h黑暗,水温为26~28 ℃,显微注射前的野生型斑马鱼亲鱼,按照雌雄比例1∶1在前一天晚上进行暗处理配组,当天光刺激后产卵,用于后续的注射。

1.2 斑马鱼aldh3a2a基因敲除靶点设计

本实验在UCSC[The University of California Santa Cruz Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/)]网站上设计aldh3a2a基因敲除靶点。先在NCBI上查询到aldh3a2a基因的DNA序列(登录号: 323653),明确该基因的内含子、外显子具体结构及其转录本的详细信息,在外显子编码(CDS)序列区域设计特异性的靶点,以保证敲除靶点对破坏该基因产生的蛋白质有效果,靶点序列、基因型检测引物序列见表1

表1  靶点及PCR所用引物序列
Tab.1  Primer sequences used in the present study

引物名称

Primer name

引物序列(5'-3')

Primer sequence (5'-3')

用途

Purpose

aldh3a2a-target

TAATACGACTCACTATAGGCACCAACAAGG

GGTTGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

Gene editing
oligo2

AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCA

AGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTT

GCTATTTCTAGCTCTAAAAC

Gene editing
aldh3a2a-F

TGTAAAACGACGGCCAGTAGTTGACTGGA

ACGTTTGGAT

Gene editing
aldh3a2a-R GTGTCTTATCATTGGGGCGTGGAACTA Gene editing
kita-F AGTGCGTCTCAAGGTGTCAG qRT-PCR
kita-R GCACTTGTCCATCAATCGGC qRT-PCR
csf1ra-F AGACTACATTTGCTGCGCTA qRT-PCR
csf1ra-R TTCGATCAAAACCCCGAGA qRT-PCR
pnp4a-F TCAAGTGCCAGGACTCGTTC qRT-PCR
pnp4a-R CTTACAGATGTCCAGCGCCA qRT-PCR
raldh2-F GAGAGGTGAAGAACGACCCG qRT-PCR
raldh2-R GGTTGTACGTGGGGAAGACC qRT-PCR
raldh3-F TTATTAAACAGACTCGCCGAT qRT-PCR
raldh3-R AATAATAGCTCCGCACACA qRT-PCR
rxrab-F CCTCACTTTTCGGACCTCCC qRT-PCR
rxrab-R AAGCTCTGTCAGCACTCTGTC qRT-PCR
mitfa-F AGGGAATTATCCGTTACTCCA qRT-PCR
mitfa-R CAAGTTCCTGAATACGGAGCA qRT-PCR
tyrp1a-F GCAGTCGACTTCAGTCACGA qRT-PCR
tyrp1a-R TAGTCCTCCACACTCTCGCA qRT-PCR
itk-F ATGGAGCCAAACCTCTTCCG qRT-PCR
itk-R TACGAACCATGAAACCCCCG qRT-PCR
aox5-F GGAAGAATATCGCAAAGCTC qRT-PCR
aox5-R GTAATTTCCTTGCGGCACT qRT-PCR
kcns3b-F ATCAAAGAAGCTGCCGGGAA qRT-PCR
kcns3b-R GCATTGTCCAAGTCGGCATC qRT-PCR
lpla-F TGGACCAGTGCAGCAAATCA qRT-PCR
lpla-R ACGCCATAGCAATTCACCCA qRT-PCR
scd-F ATGGTGAGCAAGGGCGAG qRT-PCR
scd-R TCAAGTAGTCGGGGATGTCG qRT-PCR
β-actin-F AGGTCATCACCATTGGCAAT qRT-PCR
β-actin-R GATGTCGACGTCACACTTCAT qRT-PCR

合成的sgRNA靶点包含T7启动子的特定序列和部分基因组序列,以及下游通用引物Oligo2,如表1所示。转录模板采用PCR法合成,产物采用T7高产RNA合成试剂盒(NEB公司)进行体外转录反应纯化和转录,然后使用RNA Clean & Concentrator TM-25(zymo RESEARCH)试剂盒纯化转录本,获得最终的sgRNA。cas9蛋白购自Kingsley(Z03385)。按照500 ng sgRNA和1 μL cas9蛋白的比例,将5 μL体系混合后微量注射到斑马鱼受精卵中。这些F0亲鱼被饲养到成年,并与野生型鱼杂交获得后代。PCR扩增目标位点周围250 bp区域,筛选7 bp缺失系,自交获得纯系。

1.3 黑色素细胞统计分析

随机选取90日龄的野生型和纯合突变体斑马鱼雌雄各3尾进行分析。将斑马鱼放大3倍后,在尼康立体显微镜下拍摄。随后,分别在第2色素带皮肤的1/4、1/2和3/4处,在第3色素带皮肤的1/4、1/2和3/4处划取1 mm2区域对黑色素细胞进行计数。方法是根据图像上相应的比例尺,使用Adobe Photoshop 2022软件选择帧长为1 mm×1 mm的计数区域,将选择的区域放大,用Image J软件对其中的黑色素细胞进行计数,使用GraphPad Prism 9.0.0软件对数据进行T-Test(unpaired)分析。

1.4 皮肤转录组测序与RNA的提取

转录组测序实验所用的斑马鱼均为90日龄的成鱼,分别取6尾纯合子突变体和6尾野生型斑马鱼,雌雄数量相等,从背部和腹部皮肤匀浆中提取RNA,质检后进行转录组测序。提取前,用MS-222麻醉,拍照并记录。

1.5 RNA逆转录与实时荧光定量PCR

采用HiScript Ⅲ QRT Super Mix for QPCR(Vazyme)逆转录试剂盒制备实时荧光定量PCR模板,具体操作步骤参考试剂盒说明书。测定cDNA浓度后,将cDNA样品-20 ℃保存。

实时荧光定量PCR以斑马鱼β-肌动蛋白基因为内参。实验组对每个基因使用的引物见表1,共3次重复。制备了20 μL的PCR反应,其中2×qPCR SYBR Green Master Mix为10 μL,模板DNA为1 μL,上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,ddH2O为8.2 μL。实验采用的具体PCR程序:95 ℃初始变性30 s,95 ℃变性10 s,60 ℃退火延伸30 s,40个循环。采用2-ΔΔCt法计算相应基因的相对表达量,采用GraphPad Prism 9.0.0进行统计分析。

1.6 GO富集和KEGG富集分析

每个GO项目中不同基因的富集显著性可以使用超几何分布算法计算,然后通过Fisher精确检验计算每个条目的BP、CC和MF值。

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是一个国际通用的基因组分析路径数据库。本研究利用KEGG对通路差异进行全面分析,并通过数据识别富含差异表达基因的通路。

1.7 组织切片及H.E染色

根据文献进行组织切片和H.E染色。整尾斑马鱼用10%甲醛固定,然后包埋切片。

1.8 分子进化树

在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找并下载aldh家族相关基因序列,使用MEGA软件进行序列比对和分析。

2 结果与分析

2.1 利用CRISPR/Cas9构建斑马鱼aldh3a2a纯合敲除家系

为了解aldh3a2a在斑马鱼色素细胞发育和醛代谢中的作用,利用CRISPR/cas9技术设计了aldh3a2a的sgRNA结合靶点,该靶点位于第4外显子,序列为GGCACCAACAAGAGGTTGC(图1a)。根据DNA测序结果,在靶点附近发现了1个缺失7 bp、突变1 bp的家系(图1b),并将家系命名为aldh3a2a-/-。通过在缺失的7 bp序列上设计引物(表1),并以皮肤组织cDNA为模板进行qPCR,结果显示突变体中检测到的aldh3a2a表达量远低于野生型,且差异显著(图1c)。证明aldh3a2a基因在转录水平上被成功敲除,核酸序列突变导致相应氨基酸密码提前终止,由于移码突变,野生型终止于第487号氨基酸,突变体终止于第129号氨基酸(图1d),突变体缺失358个氨基酸。

图1  aldh3a2a基因敲除纯合家系的构建

Fig.1  Construction of homozygous families with aldh3a2a gene knockout

(a) aldh3a2a基因敲除靶点设计位置;(b) 野生型斑马鱼和纯合子突变体基因序列对比;(c) 纯合子突变体中aldh3a2a基因表达量;(d) 野生型斑马鱼和纯合子突变体氨基酸数目对比;WT.野生型斑马鱼;aldh3a2a-/-.aldh3a2a纯合突变体;****.P<0.000 1。

(a) Design location of aldh3a2a gene knockout target; (b) Comparison of gene sequences between wild type zebrafish and homozygous mutant; (c) Expression of aldh3a2a gene in homozygous mutant; (d) Comparison of amino acid numbers between wild type zebrafish and homozygous mutant; WT. Wild-type zebrafish; aldh3a2a-/-. A homozygous mutant strain of zebrafish; ****.P<0.000 1.

2.2 aldh3a2a突变体的色素细胞和体脂特征

3种色素细胞在野生型和突变体斑马鱼的皮肤中分布如图所示(图2a),通过计数色素带上黑色素细胞和黄色素细胞的数量(图2b),结果显示突变体的黑色素细胞和黄色素细胞明显少于野生型。根据斑马鱼色素细胞遗传谱系的建立,人们普遍认为mitfakittyrp1a是黑色素细胞的标记基

12csf1ra是黄色素细胞的标记基13pnp4aitk是虹彩细胞的标记基14,它们参与色素细胞的发育或色素颗粒的合15

图2  aldh3a2a突变体的色素细胞和体脂特征

Fig.2  Chromatocyte and body fat characterization of aldh3a2a mutant

(a) 野生型斑马鱼和aldh3a2a纯合突变体的整体观和皮肤色素分布;(b) 斑马鱼皮肤中黑色素细胞和黄色素细胞计数及色素细胞标记基因相对表达量;(c) 野生型和突变体斑马鱼的肝组织切片;(d) 野生型和突变体斑马鱼的体长、体质量和肝脏长度;WT.野生型斑马鱼;aldh3a2a-/-.aldh3a2a纯合突变体;wf.野生型雌性斑马鱼;wm.野生型雄性斑马鱼;af.aldh3a2a纯合突变体雌性斑马鱼;am.aldh3a2a纯合突变体雄性斑马鱼;ns.无显著差异;*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001;****.P<0.000 1。

(a) Global view and skin pigment distribution of wild-type zebrafish and aldh3a2a homozygous mutant; (b) Count of melanocytes and xanthoxanthin cells and relative expression of pigment cell marker genes in zebrafish skin; (c) Liver tissue slices of wild type and mutant zebrafish; (d) Body length, weight and liver length of wild type and mutant zebrafish; WT. Wild-type zebrafish; aldh3a2a-/-. A homozygous mutant strain of zebrafish; wf. Wild-type female zebrafish; wm. Wild-type male zebrafish; af. A homozygous mutant strain of female zebrafish; am. A homozygous mutant strain of male zebrafish; ns. No significant difference; *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001; ****.P<0.000 1.

利用qPCR对3种色素细胞的标记基因进行验证,结果显示色素标记基因表达水平下调(图2b),差异显著。结果表明,3种色素细胞数量减少,色素合成能力下降。我们检测了野生型和突变体斑马鱼的体长和体质量(图2d),结果显示两者的体长没有差异,但体质量有差异。突变体的质量显著高于野生型。肝组织切片结果显示,突变体肝组织体积增大,出现圆形液泡和蜂窝状细胞(图2c),为脂肪变性的表现。

2.3 aldh3a2a转录组测序和qPCR结果分析

通过转录组测序共检测到24 054个基因,在野生型和突变型皮肤组织中均有表达。选择P<0.05 ∣log2 fold change∣>1筛选差异表达基因。结果表明,aldh3a2a突变体和野生型斑马鱼皮肤转录组中富集了204个显著上调基因和1 294个显著下调基因(图3)。

图3  aldh3a2a转录组测序和qPCR结果分析

Fig.3  Cross-linking analysis of aldh3a2a transcriptome sequencing and qPCR results

(a) 显著差异基因;(b) KEGG富集差异显著通路;(c)差异显著基因qPCR结果;WT.野生斑马鱼;aldh3a2a -/-.aldh3a2a纯合突变斑马鱼;ns.无显著差异;*.P<0.05;**.P<0.01。

(a) Significant different gene; (b) KEGG enrichment pathway with significant difference; (c) qPCR results of significantly different genes; WT. Wild-type Zebrafish; aldh3a2a-/- .A homozygous mutant strain of zebrafish; ns. No significant difference; *.P<0.05;**.P<0.01.

在差异最显著的30个基因中,npas4amhc1ubaggact3、rnasel2显著上调,tas2r202,b4galnt2、kcns3blin28ahsd3b2显著下调(图3b)。钾通道基因在黑色素细胞中是细胞自主性所必需的基因,实时荧光定量PCR结果也证实了kcns3b在突变体皮肤中的表达量显著下调(图3c),表明aldh3a2a通过干扰钾通道来减少色素细胞的形成。

KEGG信号通路富集差异最大的20条通路分别是细胞周期、范可尼贫血通路、同源重组、卵母细胞减数分裂、RNA聚合酶、糖鞘脂生物合成-球蛋白和异球蛋白系列、孕激素介导、卵母细胞成熟、RNA降解、RNA转运、p53信号通路、真核生物核糖体生物发生、DNA复制、碱基切除修复、氨基酰基-tRNA生物合成、细胞质DNA传感通路、类固醇生物合成、错配修复、类固醇激素生物合成、鞘糖脂生物合成-乳酸和新乳酸系列和抗坏血酸和醛酸盐代谢。

差异基因scdlplaaox5在类固醇生物合成途径中下调,定量PCR结果也证实了scdlplaaox5的下调,表明aldh3a2a代谢物促进了类固醇激素的合成(图3c)。

2.4 分子进化中aldh3a2aaldh1a2聚类,不与其他aldh家族基因聚类

分子进化树的结果表明,aldh3a2aaldh1a2的亲缘关系比aldh1a3的亲缘关系更近(图4

16

图4  分子进化中aldh家族基因分析

Fig.4  Gene analysis of aldh family in molecular evolution

(a) aldh基因家族进化发育树;(b) aldh3a2a缺失对aldh家族基因的影响;(c) aldh3a2a缺失对视黄酸受体(RXR和RAR)基因的影响;(d) 视黄醛脱氢酶基因raldh2的表达;(e) 视黄酸受体基因rxrab的表达;WT.野生型斑马鱼;aldh3a2a-/-.aldh3a2a纯合突变体;**.P<0.01;****.P<0.000 1。

(a) aldh gene family evolution and development tree; (b) Effects of aldh3a2a deletion on aldh family genes; (c) Effects of aldh3a2a deletion on retinoic acid receptor (RXR and RAR) genes; (d) Expression of retinal dehydrogenase gene raldh2; (e) Expression of retinoic acid receptor gene rxrab; WT. Wild-type zebrafish; aldh3a2a-/- .A homozygous mutant strain of zebrafish; **.P<0.01;****.P<0.000 1.

转录组数据显示,aldh3a2a缺失对aldh3a1、aldh3b1和aldh18a1的影响最大,影响其下调幅度超过2倍(图4b),尽管所有aldh家族基因在转录水平上没有显著差异。我们通过实时荧光定量PCR检测了aldh1、aldh2和aldh5的表达水平(部分数据未列出),结果显示突变体中aldh1a2的表达明显下调(图4d),说明aldh3a2a的功能可能是通过调节aldh1a2实现的。

aldh1a2的基因功能是通过其代谢物视黄酸来完成的。敲除aldh3a2a诱导的aldh1a2下调作用于视黄酸受体,转录组学数据显示,rarab下调,rargb上调。通过实时荧光定量PCR检测6种视黄酸RXR受体和4种视黄酸RAR受体在斑马鱼中的表达水平(数据未列出),结果显示只有RXRab显著下调(图4e)。

3 讨论

本文研究了aldh3a2a在斑马鱼色素细胞中的作用及其对醛代谢和肝脏健康的潜在影响,研究结果揭示了aldh3a2a在色素细胞发育中的重要性及其与各种生理过程的关联。

aldh3a2a在斑马鱼色素细胞的发育中起着关键作用。与野生型斑马鱼相比,敲除aldh3a2a导致突变体斑马鱼的黑色素细胞和黄色素细胞数量显著减少。此外,mitfakittyrp1acsf1ra等关键色素细胞标记基因的表达水平在突变体中下调,表明色素细胞发育和色素合成受

17。这些发现表明aldh3a2a对斑马鱼色素细胞的正常形成和功能行使至关重要。转录组分析显示,与野生型鱼相比,aldh3a2a突变体斑马鱼皮肤组织中的基因表达谱发生了显著变化。值得注意的是,与钾通道和类固醇生物合成途径相关的基因下调表明aldh3a2a可以通过这些途径调节染色质形成和类固醇激素合成。我们的结果表明aldh3a2aaldh1a2之间存在关系,aldh1a2在突变体中显著下调。aldh1a2参与视黄酸代谢,数据表明aldh1a2表达降低可能影响视黄酸受体(RAR和RXR)信号通16,具体来说,RXRab的下调表明aldh3a2a可能通过调节视黄酸信号来调节色素细胞的发育,最终影响色素沉18。GO和KEGG富集分析显示,aldh3a2a敲除后,各种生物过程和途径发生了显著变化。值得注意的是,与细胞周期、DNA修复和类固醇生物合成相关的途径受到了显著影响。这些发现提供了对aldh3a2a在色素细胞发育以外的细胞过程中更广泛的影响的见解。

已知aldh3a2a参与长链脂肪醛的代

10,这是各种细胞进程的副产物。研究证实,敲除aldh3a2a会导致该基因在转录水平下调。这种下调导致醛的积累,这可能对细胞产生不利影响,包括DNA损伤和脂质变性。在斑马鱼中观察到的肝脏异常,如肝脏肿大和圆形空泡的存在,进一步证明了aldh3a2a在防止醛诱导的细胞损伤中的重要性。

斑马鱼中aldh3a2a基因的研究对于理解其在人类中的同源基因及其相关疾病具有更广泛的意义。在人类中,aldh3a2突变与Sjögren-Larsson综合征(SLS)有关,这是一种罕见的遗传疾病,以鱼鳞病、痉挛性截瘫、智力残疾、癫痫发作和视网膜病变为特

11。本研究中使用的斑马鱼模型具有aldh3a2a基因敲除,并表现出令人联想到SLS的表型特征,如皮肤异10和脂质代谢改19。这表明我们的斑马鱼模型可以为进一步研究SLS的分子机制和潜在的治疗干预提供有价值的工具。总之,研究证明了aldh3a2a在斑马鱼色素细胞发育中的关键作用及其对醛代谢、肝脏健康和人类遗传疾病的潜在影响。进一步研究aldh3a2a影响色素细胞发育和细胞过程的机制,将有助于更深入地了解其在斑马鱼和人类中的功能和潜在的治疗靶点。

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