摘要
本研究探究了aldh3a2a在斑马鱼色素细胞发育中的意义及其对醛代谢和肝脏健康的影响。利用 CRISPR/ Cas9技术,成功构建aldh3a2a敲除纯合突变家系,导致黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞数量减少,csf1ra、pnp4a、itk下调,黑色素合成通路关键基因mitfa、tyrp1b和kita下调。转录组分析揭示了基因表达谱系的变化,差异基因scd、lpla和aox5在类固醇生物合成途径中下调,指示aldh3a2a对类固醇生物合成的关键作用。对视黄醇代谢通路的转录组分析和qpcr联合研究结果表明,aldh3a2a可以调控raldh2、rxrab以及aox5,表明其对视黄酸受体的信号传导有一定影响,同时aldh3a2a可以调控钾离子通道蛋白kcns3b,指示其对色素细胞的影响与钾离子信号传导有关。GO和KEGG富集分析发现突变体的细胞周期、同源重组、RNA 降解、RNA转运、p53信号通路、真核生物核糖体生物发生、DNA复制、碱基切除修复、氨基酰基-tRNA生物合成、细胞质 DNA 传感通路、类固醇生物合成、错配修复、类固醇激素生物合成和醛酸盐代谢等通路也有着广泛影响。此外,aldh3a2a基因敲除会导致体内醛积累明显,产生细胞毒性进而引发肝脏体积异常增大、肝脏内出现空泡,体质量增加的表征,类似于Sjögren-Larsson综合征的症状,揭示了aldh3a2a在斑马鱼体内的作用及其与人类遗传疾病的相关性,将有助于更深入地了解其在斑马鱼和人类中的功能和潜在的治疗靶点。
鱼类体色多种多样,其影响因素主要包含遗传、内分泌、环境和食物
Aldh家族在斑马鱼色素细胞发育中起着关键作用,Aldh1利用视黄醛作为底物,其代谢产物视黄酸具有激活下游基因转录的能
醛是癌细胞中氧化磷酸化和核苷酸合成增强的副产物,这些醛是由脂质过氧化物产生的,这是一种caspase非依赖性的细胞凋亡形式。醛的积累可引起DNA损伤、脂肪变性和肝坏
实验所用到的AB系野生型斑马鱼,饲养于上海海洋大学本实验室。斑马鱼的饲养光周期是14 h光照∶10 h黑暗,水温为26~28 ℃,显微注射前的野生型斑马鱼亲鱼,按照雌雄比例1∶1在前一天晚上进行暗处理配组,当天光刺激后产卵,用于后续的注射。
本实验在UCSC[The University of California Santa Cruz Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/)]网站上设计aldh3a2a基因敲除靶点。先在NCBI上查询到aldh3a2a基因的DNA序列(登录号: 323653),明确该基因的内含子、外显子具体结构及其转录本的详细信息,在外显子编码(CDS)序列区域设计特异性的靶点,以保证敲除靶点对破坏该基因产生的蛋白质有效果,靶点序列、基因型检测引物序列见
引物名称 Primer name | 引物序列(5'-3') Primer sequence (5'-3') | 用途 Purpose |
---|---|---|
aldh3a2a-target |
TAATACGACTCACTATAGGCACCAACAAGG GGTTGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC | Gene editing |
oligo2 |
AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCA AGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTT GCTATTTCTAGCTCTAAAAC | Gene editing |
aldh3a2a-F |
TGTAAAACGACGGCCAGTAGTTGACTGGA ACGTTTGGAT | Gene editing |
aldh3a2a-R | GTGTCTTATCATTGGGGCGTGGAACTA | Gene editing |
kita-F | AGTGCGTCTCAAGGTGTCAG | qRT-PCR |
kita-R | GCACTTGTCCATCAATCGGC | qRT-PCR |
csf1ra-F | AGACTACATTTGCTGCGCTA | qRT-PCR |
csf1ra-R | TTCGATCAAAACCCCGAGA | qRT-PCR |
pnp4a-F | TCAAGTGCCAGGACTCGTTC | qRT-PCR |
pnp4a-R | CTTACAGATGTCCAGCGCCA | qRT-PCR |
raldh2-F | GAGAGGTGAAGAACGACCCG | qRT-PCR |
raldh2-R | GGTTGTACGTGGGGAAGACC | qRT-PCR |
raldh3-F | TTATTAAACAGACTCGCCGAT | qRT-PCR |
raldh3-R | AATAATAGCTCCGCACACA | qRT-PCR |
rxrab-F | CCTCACTTTTCGGACCTCCC | qRT-PCR |
rxrab-R | AAGCTCTGTCAGCACTCTGTC | qRT-PCR |
mitfa-F | AGGGAATTATCCGTTACTCCA | qRT-PCR |
mitfa-R | CAAGTTCCTGAATACGGAGCA | qRT-PCR |
tyrp1a-F | GCAGTCGACTTCAGTCACGA | qRT-PCR |
tyrp1a-R | TAGTCCTCCACACTCTCGCA | qRT-PCR |
itk-F | ATGGAGCCAAACCTCTTCCG | qRT-PCR |
itk-R | TACGAACCATGAAACCCCCG | qRT-PCR |
aox5-F | GGAAGAATATCGCAAAGCTC | qRT-PCR |
aox5-R | GTAATTTCCTTGCGGCACT | qRT-PCR |
kcns3b-F | ATCAAAGAAGCTGCCGGGAA | qRT-PCR |
kcns3b-R | GCATTGTCCAAGTCGGCATC | qRT-PCR |
lpla-F | TGGACCAGTGCAGCAAATCA | qRT-PCR |
lpla-R | ACGCCATAGCAATTCACCCA | qRT-PCR |
scd-F | ATGGTGAGCAAGGGCGAG | qRT-PCR |
scd-R | TCAAGTAGTCGGGGATGTCG | qRT-PCR |
β-actin-F | AGGTCATCACCATTGGCAAT | qRT-PCR |
β-actin-R | GATGTCGACGTCACACTTCAT | qRT-PCR |
合成的sgRNA靶点包含T7启动子的特定序列和部分基因组序列,以及下游通用引物Oligo2,如
随机选取90日龄的野生型和纯合突变体斑马鱼雌雄各3尾进行分析。将斑马鱼放大3倍后,在尼康立体显微镜下拍摄。随后,分别在第2色素带皮肤的1/4、1/2和3/4处,在第3色素带皮肤的1/4、1/2和3/4处划取1 m
转录组测序实验所用的斑马鱼均为90日龄的成鱼,分别取6尾纯合子突变体和6尾野生型斑马鱼,雌雄数量相等,从背部和腹部皮肤匀浆中提取RNA,质检后进行转录组测序。提取前,用MS-222麻醉,拍照并记录。
采用HiScript Ⅲ QRT Super Mix for QPCR(Vazyme)逆转录试剂盒制备实时荧光定量PCR模板,具体操作步骤参考试剂盒说明书。测定cDNA浓度后,将cDNA样品-20 ℃保存。
实时荧光定量PCR以斑马鱼β-肌动蛋白基因为内参。实验组对每个基因使用的引物见
每个GO项目中不同基因的富集显著性可以使用超几何分布算法计算,然后通过Fisher精确检验计算每个条目的BP、CC和MF值。
KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是一个国际通用的基因组分析路径数据库。本研究利用KEGG对通路差异进行全面分析,并通过数据识别富含差异表达基因的通路。
在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找并下载aldh家族相关基因序列,使用MEGA软件进行序列比对和分析。
为了解aldh3a2a在斑马鱼色素细胞发育和醛代谢中的作用,利用CRISPR/cas9技术设计了aldh3a2a的sgRNA结合靶点,该靶点位于第4外显子,序列为GGCACCAACAAGAGGTTGC(
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图1 aldh3a2a基因敲除纯合家系的构建
Fig.1 Construction of homozygous families with aldh3a2a gene knockout
(a) aldh3a2a基因敲除靶点设计位置;(b) 野生型斑马鱼和纯合子突变体基因序列对比;(c) 纯合子突变体中aldh3a2a基因表达量;(d) 野生型斑马鱼和纯合子突变体氨基酸数目对比;WT.野生型斑马鱼;aldh3a2
(a) Design location of aldh3a2a gene knockout target; (b) Comparison of gene sequences between wild type zebrafish and homozygous mutant; (c) Expression of aldh3a2a gene in homozygous mutant; (d) Comparison of amino acid numbers between wild type zebrafish and homozygous mutant; WT. Wild-type zebrafish; aldh3a2
3种色素细胞在野生型和突变体斑马鱼的皮肤中分布如图所示(
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图2 aldh3a2a突变体的色素细胞和体脂特征
Fig.2 Chromatocyte and body fat characterization of aldh3a2a mutant
(a) 野生型斑马鱼和aldh3a2a纯合突变体的整体观和皮肤色素分布;(b) 斑马鱼皮肤中黑色素细胞和黄色素细胞计数及色素细胞标记基因相对表达量;(c) 野生型和突变体斑马鱼的肝组织切片;(d) 野生型和突变体斑马鱼的体长、体质量和肝脏长度;WT.野生型斑马鱼;aldh3a2
(a) Global view and skin pigment distribution of wild-type zebrafish and aldh3a2a homozygous mutant; (b) Count of melanocytes and xanthoxanthin cells and relative expression of pigment cell marker genes in zebrafish skin; (c) Liver tissue slices of wild type and mutant zebrafish; (d) Body length, weight and liver length of wild type and mutant zebrafish; WT. Wild-type zebrafish; aldh3a2
利用qPCR对3种色素细胞的标记基因进行验证,结果显示色素标记基因表达水平下调(
通过转录组测序共检测到24 054个基因,在野生型和突变型皮肤组织中均有表达。选择P<0.05 ∣log2 fold change∣>1筛选差异表达基因。结果表明,aldh3a2a突变体和野生型斑马鱼皮肤转录组中富集了204个显著上调基因和1 294个显著下调基因(
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图3 aldh3a2a转录组测序和qPCR结果分析
Fig.3 Cross-linking analysis of aldh3a2a transcriptome sequencing and qPCR results
(a) 显著差异基因;(b) KEGG富集差异显著通路;(c)差异显著基因qPCR结果;WT.野生斑马鱼;aldh3a2a
(a) Significant different gene; (b) KEGG enrichment pathway with significant difference; (c) qPCR results of significantly different genes; WT. Wild-type Zebrafish; aldh3a2
在差异最显著的30个基因中,npas4a、mhc1uba、ggact3、rnasel2显著上调,tas2r202,b4galnt2、kcns3b、lin28a、hsd3b2显著下调(
KEGG信号通路富集差异最大的20条通路分别是细胞周期、范可尼贫血通路、同源重组、卵母细胞减数分裂、RNA聚合酶、糖鞘脂生物合成-球蛋白和异球蛋白系列、孕激素介导、卵母细胞成熟、RNA降解、RNA转运、p53信号通路、真核生物核糖体生物发生、DNA复制、碱基切除修复、氨基酰基-tRNA生物合成、细胞质DNA传感通路、类固醇生物合成、错配修复、类固醇激素生物合成、鞘糖脂生物合成-乳酸和新乳酸系列和抗坏血酸和醛酸盐代谢。
差异基因scd、lpla和aox5在类固醇生物合成途径中下调,定量PCR结果也证实了scd、lpla和aox5的下调,表明aldh3a2a代谢物促进了类固醇激素的合成(
分子进化树的结果表明,aldh3a2a与aldh1a2的亲缘关系比aldh1a3的亲缘关系更近(
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图4 分子进化中aldh家族基因分析
Fig.4 Gene analysis of aldh family in molecular evolution
(a) aldh基因家族进化发育树;(b) aldh3a2a缺失对aldh家族基因的影响;(c) aldh3a2a缺失对视黄酸受体(RXR和RAR)基因的影响;(d) 视黄醛脱氢酶基因raldh2的表达;(e) 视黄酸受体基因rxrab的表达;WT.野生型斑马鱼;aldh3a2
(a) aldh gene family evolution and development tree; (b) Effects of aldh3a2a deletion on aldh family genes; (c) Effects of aldh3a2a deletion on retinoic acid receptor (RXR and RAR) genes; (d) Expression of retinal dehydrogenase gene raldh2; (e) Expression of retinoic acid receptor gene rxrab; WT. Wild-type zebrafish; aldh3a2
转录组数据显示,aldh3a2a缺失对aldh3a1、aldh3b1和aldh18a1的影响最大,影响其下调幅度超过2倍(
aldh1a2的基因功能是通过其代谢物视黄酸来完成的。敲除aldh3a2a诱导的aldh1a2下调作用于视黄酸受体,转录组学数据显示,rarab下调,rargb上调。通过实时荧光定量PCR检测6种视黄酸RXR受体和4种视黄酸RAR受体在斑马鱼中的表达水平(数据未列出),结果显示只有RXRab显著下调(
本文研究了aldh3a2a在斑马鱼色素细胞中的作用及其对醛代谢和肝脏健康的潜在影响,研究结果揭示了aldh3a2a在色素细胞发育中的重要性及其与各种生理过程的关联。
aldh3a2a在斑马鱼色素细胞的发育中起着关键作用。与野生型斑马鱼相比,敲除aldh3a2a导致突变体斑马鱼的黑色素细胞和黄色素细胞数量显著减少。此外,mitfa、kit、tyrp1a、csf1ra等关键色素细胞标记基因的表达水平在突变体中下调,表明色素细胞发育和色素合成受
已知aldh3a2a参与长链脂肪醛的代
斑马鱼中aldh3a2a基因的研究对于理解其在人类中的同源基因及其相关疾病具有更广泛的意义。在人类中,aldh3a2突变与Sjögren-Larsson综合征(SLS)有关,这是一种罕见的遗传疾病,以鱼鳞病、痉挛性截瘫、智力残疾、癫痫发作和视网膜病变为特
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