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脱脂南极磷虾粉中降血糖与抗氧化肽的分离纯化与鉴定  PDF

  • 赵侠
  • 李燕
  • 孙慧敏
  • 郑昌亮
  • 宋益善
上海海洋大学 食品学院,上海 201306

中图分类号: TS 254.1

最近更新:2023-11-24

DOI: 10.12024/jsou.20230104059

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摘要

食源性二肽基肽酶Ⅳ(Dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)抑制肽和抗氧化肽分别有助于清除体内自由基和调节机体血糖。为实现脱脂南极磷虾粉的高值化利用,以及为糖尿病治疗寻找新方法,本研究从脱脂南极磷虾粉酶解产物中制备DPP-Ⅳ抑制肽和抗氧化肽段。使用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰酶水解脱脂南极磷虾粉,探究时间与水解度、活性、产率的关系,并分离纯化多肽,最后通过分子对接确定抑制作用位点。结果表明,酶解液经超滤、Sephadex G15分离纯化和液相-质谱联用技术鉴定后,得到了4条具有DPP-Ⅳ抑制和抗氧化作用的肽,氨基酸序列分别为WPPLSPFRCPR、IPDWFLNRQ、FLWLKKTPLPL和DTVPWFPR。其中IPDWFLNRQ具备较高的DPP-Ⅳ抑制活性,DPP-Ⅳ抑制活性IC50值为(0.616±0.097) mmol/L;WPPLSPFRCPR具有较高的抗氧化活性,DPPH EC50值为(0.098 3±0.011) mmol/L,ABTS EC50值为(0.116±0.073) mmol/L。分子对接结果表明这4个肽主要通过氢键与DPP-Ⅳ活性中心及其以外的位点相结合,从而达到抑制DPPP-Ⅳ活性的作用。本研究基于脱脂南极磷虾粉制备食源性DPP-Ⅳ抑制肽和抗氧化肽,以期为南极磷虾粉的开发利用提供理论依据。

糖尿病是一种以高血糖为主要特征的代谢性疾病,会引发肾功能衰竭、心脏病变等糖尿病并发症,多数是由于患者体内活性氧自由基水平升高,导致氧化应激而引发

1-2。抗氧化剂可以通过减少自由基的产生、直接淬灭体内自由基及增强机体的抗氧化能力等途径来减少氧化损伤,从而达到预防糖尿病及其并发症的作用。DPP-Ⅳ(二肽基肽酶Ⅳ)抑制剂目前普遍用于临床降血糖治疗,常用的抑制剂有西格列丁、沙格列丁等,但是长期服用会引起一系列的副作3。据报道,活性肽具有无毒、温和、易吸收的特点,一些抗氧化肽除了具有抗氧化功能活性,还可通过抑制DPP-Ⅳ的活性来延迟人体对葡萄糖的吸收达到降血糖的目4。这使得从天然蛋白质中提取得到的食源性DPP-Ⅳ抑制肽和抗氧化肽具有突出优势而备受关注。

南极磷虾(Euphausia superba)生物资源量为3.42亿~3.56亿t。南极磷虾氨基酸种类丰富、蛋白质含量高,是世界上最大的动物蛋白质资源,其蛋白质中含有8种必需氨基酸,被认为是未来海洋食品和保健品中最合适和最丰富的资

5。脱脂南极磷虾粉是南极磷虾虾油加工的副产物,其蛋白质含量超过65%,具有高蛋白低脂肪的特点。目前,南极磷虾蛋白水解物表现出多种生物活性,是提取生物活性肽的优质原料。ZHAO6从南极磷虾蛋白水解物中分离出8种抗高血压肽;SUN7发现锌与南极磷虾肽鳌合后比硫酸锌和葡萄糖酸锌在胃肠道中更稳定;PARK8发现胃蛋白酶酶解南极磷虾4 h得到的水解产物具有最高的DPPH清除活性和ACE(血管紧张素Ⅰ转换酶)抑制活性。然而,关于从脱脂南极磷虾粉中提取到同时具有DPP-Ⅳ抑制活性和抗氧化活性的多肽研究很少。

因此,本研究以脱脂南极磷虾粉为原料,通过酶解法提取多肽,以ABTS和DPPH自由基清除能力以及DPP-Ⅳ抑制能力为标准,采用超滤和凝胶层析技术进行纯化。最后对活性肽进行结构鉴定,并通过分子对接研究DPP-Ⅳ抑制肽的抑制机理,以期为脱脂南极磷粉的高值化利用和降血糖、抗氧化药物的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂南极磷虾粉由山东康境海洋生物工程有限公司(山东,中国)于2022年2月提供。其中,水分含量为5.98%,粗蛋白含量为72.26%,粗脂肪含量为3.02%,灰分含量为10.23%。碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶均来自天津诺奥酶促有限公司(天津,中国)。DPP-Ⅳ抑制剂筛选试剂盒、邻苯二甲醛(OPA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)均购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(上海,中国)。其他试剂均为分析级,来自北京百灵威科技有限公司(北京,中国)。

1.2 仪器与设备

主要仪器与设备:GL-21M 高速冷冻离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;HDB-7L核酸蛋白检测仪、CBA-A程控多功能全自动部分收集器,上海沪西分析仪器有限公司;FD-1PF冷冻干燥机,北京德天游有限公司;FLEXSTATION3多功能读板机,美国Molecular Devices公司;ULTIMATE3000毛细管高效液相色谱仪、Q EXACTIVE四级杆-静电场轨道阱高分辨液相色谱-质谱联用仪,赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 脱脂南极磷虾酶解液的制备

脱脂南极磷虾粉放入8倍体积的蒸馏水中,水浴加热至55 ℃保持30 min,然后加入碱性蛋白酶、胰酶和中性蛋白酶,每种酶的剂量为1%(质量分数)。在分别反应1、2、3、4、5、6 h后,将水解物取出再次加热到90 ℃保持20 min,使酶失活,然后离心30 min(10 000×g,4℃)。上清液冻干后在-20 ℃保存(最长保存期限为3个月)。在冻干后,肽的得率(Y)的计算公式:

Y%=W1W2×100% (1)

式中:W1W2分别为冻干后肽粉的质量和虾粉蛋白的质量,g。

参考TANG

9的方法,使用OPA法对酶解液的水解度进行测定。将1.91 g四硼酸钠,100 mg十二烷基硫酸钠,88 mg二硫苏糖醇,溶于50 mL蒸馏水中制备OPA试剂。然后,在避光环境中将80 mg OPA试剂溶解在2 mL无水乙醇中。用蒸馏水定容至100 mL。使用甘氨酸标准品与OPA试剂反应,绘制标准曲线。将水解产物稀释至4 mg/mL。取500 μL样品与3 mL OPA试剂混合,反应2 min后,用紫外分光光度计测定其在335 nm处的吸光度。水解度(DH)计算公式:

DH%=hhtot×100% (2)

式中:h为通过甘氨酸标准曲线计算断裂肽键数;htot为单位重量的肽键总数。

1.3.2 DPP-Ⅳ抑制活性的测定

将肽溶解在Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L, pH 8.0)中制备样品溶液,50 μL DPP-Ⅳ (10 U/L)和25 μL样品在96孔板37 ℃孵育10 min。然后加入25 μL Gly-Pro-pNA(1.6 mmol/L)底物,37 ℃孵育15 min后测定其荧光强度。DPP-Ⅳ抑制率(WDPP-Ⅳ)计算公式:

WDPP-%=Fcontrol-(Fsample-Fblank)Fcontrol×100% (3)

式中:Fcontrol为对照组的荧光值;Fsample为样品组的荧光值;Fblank为空白组的荧光值。

1.3.3 DPPH自由基清除活性

首先,将1.5 mL肽溶液(5 mg/mL)与等体积5 mg/100 mL浓度的DPPH溶液混合,并在避光的环境中保存30 min。使用紫外分光光度计在517 nm测量。DPPH自由基清除率(WDPPH)计算公式:

WDPPH(%)=1-AsampleAblank×100% (4)

式中:Asample为样品组的吸光度;Ablank为空白组的吸光度。

1.3.4 ABTS自由基清除活性

7 mmol/L ABTS与2.45 mmol/L过硫酸钾混合,在黑暗中保存16 h后,用0.2 mol/L PBS (pH 7.4)稀释该混合物制备ABTS溶液,此时ABTS溶液的吸光度在734 nm处为0.70 ± 0.02。然后,将30 μL肽溶液(5 mg/mL)与3 mL ABTS溶液混匀,在避光的环境中放置6 min。然后在734 nm处读取吸光度。ABTS自由基清除活性(WABTS)计算公式:

WABTS%=Ablank-AsampleAblank×100% (5)

式中:Asample为样品组的吸光度;Ablank为空白组的吸光度。

1.3.5 酶解液超滤分离

脱脂南极磷虾粉酶解液经过超滤,在不同的分子量≥10 ku, 10 ku>MW≥5 ku, 5 ku>MW≥3 ku和<3 ku范围内收集,收集的4个组分被浓缩、冻干并保存在-20 ℃进一步分析。

1.3.6 凝胶过滤层析

将目标超滤组分溶于去离子水(20 mg/mL)中。将5 mL样品注入Sephadex G-15凝胶柱然后使用去离子水洗脱样品。按照每6 min收集一次,用核酸蛋白检测仪在254 nm下测定样品洗脱曲线的吸光度。肽段按照得到的6个峰进行分组。收集不同的组分,冻干,然后存储在-20 ℃以进一步分析。

1.3.7 质谱鉴定

参考LANG

10的方法,使用LC-MS/MC测定脱脂南极磷虾肽的氨基酸序列。

1.3.8 分子对接

通过同源对比和检索从PDB数据库(http://www.rcsb.org/pdb)获取DPP-Ⅳ(PDB ID:5y7h)的三维晶体结构,使用AutoDock软件对DPP-Ⅳ受体蛋白进行处理,多肽的3D结构采用PyMol 2.5.4构建,将多肽配体和DPP-Ⅳ受体进行对

11。来研究所鉴定的肽与DPP-Ⅳ的抑制机制。

1.3.9 肽的筛选与合成

通过PeptideRanker软件(http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker)预测多肽的潜在生物活性,使用iDPPIV-SCM软件(http://camt.pythonanywhere.com/iDPPIV-SCM)对多肽的DPP-Ⅳ抑制活性进行评分,根据CONWAY

12的方法对多肽的抗氧化活性进行了评分。从LC-MS/MS鉴定结果中筛选出的多肽由杭州丹港有限公司合成。通过反相高效液相色谱-质谱联用分析,合成的多肽纯度在95%以上。

1.4 数据分析

所有的测定进行3次。每组数据使用IBM SPSS Statistics 23进行方差分析,以多重比较法进行显著性分析(P < 0.05)。采用Originpro 2020进行绘图,图中标有不同字母表示组间有显著性差异(P < 0.05)。

2 结果与讨论

2.1 脱脂南极磷虾粉酶解液的产率、水解度和活性

水解度能反映肽键的裂解程度,与肽链的长度有关,也会影响其结构中氨基酸的暴露情况和生物活性。如图1所示,在水解的初始阶段,即前2 h,大量肽键被裂解水解,水解度迅速上升。后面趋于平缓,是因为酶解前期大量肽链被切断,释放出大量短肽。JIN

13在使用4种不同的酶处理大西洋鲑鱼皮时水解度在前60 min时急剧增加,随后水解度开始平缓。HONG14通过风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶水解鲢鱼鱼鳔发现,水解度在第1小时内快速增长。在本实验中酶解脱脂南极磷虾粉时,水解度上升时间较长,其原因可能是虾粉蛋白质含量高且水分含量较少,在酶解初始阶段,部分蛋白质未与溶剂接触,但是经过长时间的浸泡后,未接触部分开始暴露,故水解度在3 h前持续上升。由图2也可得知,酶解时间越久,肽的产率也会逐渐升高,这是因为一些难溶的蛋白开始溶解后被酶酶解。

图1  酶解时间与水解度之间的关系

Fig.1  Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

相同小写字母表示差异不显著(P > 0.05),不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。

Values marked with the same lowercase letter mean no significant difference (P > 0.05), while with different lowercase letters mean significant difference(P < 0.05).

脱脂南极磷虾粉酶解液的活性测定见图3图4。在水解4 h后,酶解产物表现出较高的抗氧化性能(ABTS自由基清除率为34.35%±1.30%,DPPH自由基清除率为43.50%±1.20%,肽质量浓度为5 mg/mL)。肽的抗氧化性能与分子量、氨基酸组成和疏水性相关。在刘辉

15的研究中,从大豆蛋白中纯化鉴定出抗氧化肽IPPGVPY,其分子质量为741.4 u,并且具有较多的疏水性氨基酸。同时,在4 h时酶解液的DPP-Ⅳ抑制活性也达到了一个较高的水平,这是因为DPP-Ⅳ抑制肽和抗氧化肽具有一定的共性,即多肽的疏水性以及较低的分子量,因此在酶解时间4 h时,酶解产物的生物活性都达到了一个较高水平。

图2  酶解时间与肽得率之间的关系

Fig.2  Effect of hydrolysis time on peptides yield

相同小写字母表示差异不显著(P > 0.05),不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。

Values marked with the same lowercase letter mean no significant difference(P > 0.05), while with different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05).

图3  脱脂南极磷虾水解物酶解时间与DPPH和ABTS自由基清除活性的关系(5 mg/mL)

Fig.3  Effect of hydrolysis time on DPPH and ABTS free radical scavenging of Antarctic krill hydrolysates (5 mg/mL)

相同小写字母表示差异不显著(P > 0.05),不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。

Values marked with the same lowercase letter mean no significant difference(P > 0.05), while with different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05).

图4  酶解时间与肽得率之间的关系脱脂南极磷虾水解物酶解时间与DPP-Ⅳ抑制活性的关系(20 mg/mL)

Fig.4  Effect of hydrolysis time on DPP-Ⅳ inhibitory activity of Antarctic krill hydrolysates (20 mg/mL)

相同小写字母表示差异不显著(P > 0.05),不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。

Values marked with the same lowercase letter mean no significant difference(P > 0.05), while with different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05).

2.2 脱脂南极磷虾粉酶解液超滤分离

超滤是一种根据溶液中分子大小来分离溶液中分子的技

16。酶解4 h的水解物具有较高的生物活性,将其通过超滤分为4个组分:≥10 ku、10 ku>MW≥5 ku、5 ku>MW≥3 ku和<3 ku。其体外抗氧化能力、DPP-Ⅳ抑制活性如表1所示。如表所示,<3 ku的多肽组分具有明显高于原水解物和其他3个超滤组分生物活性的特点,相比原始酶解产物,<3 ku组分DPP-Ⅳ抑制活性提高了6%,DPPH自由清除活性提高了27%,ABTS自由基清除活性提高了16%。WANG17从鲭鱼中提取抗氧化肽,通过超滤发现分子量低于3 ku的肽表现出最高的DPPH自由基清除活性。尹剑18酶解鲟鱼皮胶原蛋白,发现超滤得到的<3 ku的组分具有更高的DPP-Ⅳ抑制活性,这些研究结果与本研究结果类似。通过超滤富集了低分子量的多肽组分,提高了多肽抗氧化活性和DPP-Ⅳ抑制活19,进一步表明了较低分子量的肽具有较高的生物活性。因此,将水解物中<3 ku的超滤组分进行下一阶段的纯化。

2.3 葡聚糖Sephadex-G15分离

与超滤不同的是葡聚糖凝胶过滤可以以更精细的方式分离不同分子量的水解物。在本实验中,分子量<3 ku的馏分通过Sephadex G-15柱后被分离成6个组分(M1、M2、M3、M4、M5和M6,见图5。如图6~8所示,M3与其他各组相比表现出最高的抗氧化活性,其DPPH自由基清除率为77.99%±1.20%,ABTS自由基清除率为84.60%±0.20%。M3的DPP-Ⅳ抑制活性也高于其他2个馏分,其抑制率为57.23%±0.48%(肽质量浓度:5 mg/mL)。这些结果表明,M3同时具有较高的抗氧化和DPP-Ⅳ抑制活性。ZHANG

20也发现采用凝胶色谱法分离鳙鱼肌肉水解物后的一种成分中同时具有较高的DPP-Ⅳ抑制活性和DPPH自由基清除活性。这些发现证实了分子大小在决定多肽的生物活性方面起着关键作用。因此,收集M3馏分用于进一步分析肽的序列。

表1  超滤组分的抗氧化活性和DPP-Ⅳ抑制活性
Tab.1  Antioxidant activity and DPP-Ⅳ inhibitory activity of ultrafiltration fractions.

超滤组分

Ultrafiltration fractions

DPP-Ⅳ抑制率20 mg/mL

DPP-Ⅳ inhibitory activity /%

DPPH自由基清除活性5 mg/mL

DPPH free radical scavenging /%

ABTS自由基清除活性5 mg/mL

ABTS free radical scavenging /%

≥10 ku 45.67±1.20a 16.73±2.10a 27.48±1.10b
10 ku>MW≥5 ku 52.73±0.14b 34.68±0.75b 20.37±0.73a
5 ku>MW≥3 ku 70.94±0.78c 42.29±1.20c 40.33±2.20c
< 3 ku 83.12±0.77d 55.40±0.45d 40.25±1.10d

注:  相同小写字母表示差异不显著(P > 0.05),不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。

Notes:   Values marked with the same lowercase letter mean no significant difference(P > 0.05), while with different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05).

图5  Sephadex G-15凝胶色谱图

Fig.5  Sephadex G-15 gel chromatogram

图6  各组分DPP-Ⅳ抑制活性

Fig.6  Inhibition activity of DPP-Ⅳ of fraction

相同小写字母表示差异不显著(P > 0.05),不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。

Values marked with the same lowercase letter mean no significant difference(P > 0.05), while with different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05).

2.4 LC-MS/MS质谱鉴定

通过LC-MS/MS共鉴定了128条来自M3组分的肽。在所有的肽段中,根据肽段的MS/MS谱的得分、PeptideRanker软件的预测分数、iDPPIV-SCM软件评分并根据CONWAY

12的方法对多肽序列进行了评分。根据评分结果,模拟筛选出6条(Trp-Pro-Pro-Leu-Ser-Pro-Phe-Arg-Cys-Pro-Arg,Asn-Arg-Pro-Ile-Pro-Trp-Ile,Ile-Pro-Asp-Trp-Phe-Leu-Asn-Arg-Gln,Pro-Phe-Gly-Leu-Tyr-Val-His-His-Ser-Trp-Phe, Phe-Leu-Trp-Leu-Lys-Lys-Thr-Pro-Leu, Asp-Thr-Val-Pro-Trp-Phe-Pro-Arg)具有潜在高抗氧化和降血糖活性的肽,其MS/MS图谱见图9

图7  各组分DPPH自由基清除活性

Fig.7  DPPH radical scavenging activity of fractions

相同小写字母表示差异不显著(P > 0.05),不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。

Values marked with the same lowercase letter mean no significant difference(P > 0.05), while with different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05).

图8  各组分ABTS自由基清除活性

Fig.8  ABTS radical scavenging activity of fractions

相同小写字母表示差异不显著(P > 0.05),不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。

Values marked with the same lowercase letter mean no significant difference(P > 0.05), while with different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05).

多肽的生物活性往往与它们所含的特定氨基酸的比例和这些氨基酸的位置有

1221。研22表明,一些具有较高抗氧化活性的肽序列,其结构中一般含有这几种氨基酸Leu、Val、Gly、Ala和Pro。MEDNDIS23纯化了来自巨型鱿鱼皮明胶的多肽,发现疏水氨基酸含量高的多肽显示出强大的抗氧化活性。同样,RANATHUNGA24发现,来自海鳗的高抗氧化肽也含有高比例的疏水性氨基酸,包括Leu、Gly和Val。这些发现表明,疏水氨基酸的比例可以决定多肽的抗氧化活性。在我们筛选出6个多肽序列中,除了PFGLYVHHSWF外,其他都有2~6个上述特征氨基酸,WPPLSPFRCPR具有最高的抗氧化活性[DPPH EC50:(0.098 3±0.011) mmol/L,ABTS EC50:(0.116±0.073) mmol/L],可能是因为它具有计较多数量的Pro,这进一步证实了特定氨基酸对抗氧化活性的重要性。

图 9  M3组分的6条多肽MS/MS图谱

Fig.9  Sequence profile of six of the peptides identified from M3 fraction

一般来说,具有高疏水性氨基酸残基的肽可以抑制DPP-Ⅳ的活

25,特别是N端有Trp的多18。WPPLSPFRCPR具有这种特征结构,因此显示出较高的DPP-Ⅳ抑制活26。其他DPP-Ⅳ 抑制肽的有关的结构特征包括肽中第二位氨基酸为Pro或 Ala,以及 N 端氨基酸为 Leu 或 Ile。WPPLSPFRCPR和IPDWFLNRQ具有这些典型结构。在分析的6个序列中,有4个序列的DPP-Ⅳ IC50小于5 mmol/L,这与以前的研究一27。为了进一步研究DPP-Ⅳ抑制肽的活性机制,对这4条DPP-Ⅳ抑制肽进行了分子对接研究

2.5 分子对接

在这项研究中,AutoDock Vina软件用来模拟DPP-Ⅳ单体与4个选定的肽的对接。亲和力分数是基于各种因素,包括空间效应、排斥、氢键、疏水相互作用和受体-配体复合物之间的灵活性,反映了配体与受体有效结合的可能性。较低的对接分数表明肽和DPP-Ⅳ之间有更好的结合构

28。亲和力为负值表明有结合的可能性,一般来说,小于-6 kcal/mol的值表明有很大的结合可能性。在这项研究中,多肽IPDWFLNRQ的对接分数最低(-8.6 kcal/mol),这与体外实验的结果一致。

图10是4种肽和DPP-Ⅳ组合的三维图,可以更清楚地看到对接模式。DPP-Ⅳ有3个结合袋,S1活性位点由Tyr547、Ser630、Tyr631、Val656、Trp659、Tyr662、Asn710、Val711和His740组成;S2活性位点由Glu205、Glu206和Tyr662组成;S3活性位点由Ser209、Arg358和Phe357组

29。对接能量得分列于表3。一般来说,与反应中心的一个口袋结合的亲和能量较低的肽更有可能成为抑制剂,而亲和能量较高的肽则不太可能成为抑制剂。从图10a和10b可以看出,WPPLSPFRCPR结合在蛋白质的内部空腔中。相互作用细节图宣布,短肽WPPLSPFRCPR上的Trp1、Pro3、Ser5、Pro6、Arg8、Arg11与DPP-Ⅳ蛋白上的Asp545、Tyr752、Ser630、Arg125、Asp556、Tyr456氢键结合。IPDWFLNRQ上的Ile1、Pro2、Asp3、Arg8、Gln9与DPP-Ⅳ蛋白上的Tyr585、Cys551、Tyr456、Gln553、Tyr547、Glu206和His740氢键结合。 FLWLKKTPLPL上的Phe1、Lys5、Lys6、Pro8、Pro10分别与DPP-Ⅳ蛋白上的His126、Gly741、Ile742、His748、Val546、Asp545、Arg560、Gln553氢键。 DTVPWFPR上的Asp1、Pro4和Arg8分别与DPP-IV蛋白上的Tyr662、Gln553、Tyr631、Gly741、Ser630和Tyr752氢键。除FLWLKKTPLPL外,其他3种肽都与DPP-Ⅳ的活性口袋形成氢键。然而,根据图10c,FLWLKKTPLPL的结合点也在DPP-Ⅳ活性部位附近。因此,除了氢键与DPP-Ⅳ功能位点结合外,可能还有其他相互作用,需要进一步探索。

表 2  脱脂南极磷虾粉肽序列及对DPP-Ⅳ的半抑制浓度(IC50)、DPPH和ABTS自由基清除活性(EC50
Tab.2  Peptides identified in collected fractions M3 were synthesized to evaluate their DPP-Ⅳ inhibitory activity, DPPH free radical scavenging and ABTS free radical scavenging

肽序列

Peptide sequence

分子量

Molecular weight/u

DPP-IV

IC50 /(mmol/L)

DPPH

EC50 /(mmol/L)

ABTS

EC50/(mmol/L)

WPPLSPFRCPR 1 355 2.121±0.31 0.098 3±0.011 0.116±0.073
NRPIPPWI 991.6 >5 1.249±0.044 4.123±0.067
IPDWFLNRQ 1 188 0.616±0.97 3.083±0.038 1.466±0.040
PFGLYVHHSWF 1 389 >5 1.416±0.076 >5
FLWLKKTPLPL 1 355 1.158±0.71 2.083±0.053 4.663±0.022
DTVPWFPR 1 017 4.923±2.0 0.802±0.078 2.471±0.043
表3  多肽与DPP-Ⅳ分子对接模拟的能量参数
Tab.3  Molecular docking binding energy score of for peptides and DPP-Ⅳ
蛋白 Protein结合能 Binding energy/(kcal/mol)
DPP-Ⅳ WPPLSPFRCPR IPDWFLNRQ FLWLKKTPLPL DTVPWFPR
-8.4 -8.6 -8.4 -8.3

图10  四条肽与DPP-Ⅳ结合的3D图

Fig.10  3D diagrams of the combination of the four superior peptides and DPP-Ⅳ

3 结论

该研究首次从脱脂南极磷虾粉中提取并鉴定出具有双重生物活性的肽序列。研究得出,低分子量的肽组分具有更强的DPP-Ⅳ抑制活性和抗氧化活性。通过超滤、Sephadex G-15和LC-MSMS,从活性最高的组分中确定了4种新的、高效的生物活性肽。分子对接证实4种肽都能通过氢键与DPP-Ⅳ的活性部位结合。因此,从脱脂南极磷粉中提取的多肽可以为降血糖、抗氧化药物的开发提供理论依据。

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