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雌性三角帆蚌Srd5a1基因的分子鉴定和功能研究  PDF

  • 曹慕莲 1
  • 霍滢朵 1
  • 刘宗雨 1
  • 缪煜琳 1
  • 金鑫 1
  • 汪桂玲 1,2,3
1. 上海海洋大学 农业农村部淡水水产种质资源重点实验室,上海 201306; 2. 上海海洋大学 上海水产养殖工程技术研究中心,上海 201306; 3. 上海海洋大学 水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心,上海 201306

中图分类号: S 917.4

最近更新:2024-03-18

DOI: 10.12024/jsou.20230304116

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摘要

性类固醇激素与生物生殖、配子排放以及性腺发育密切相关,Srd5a1基因在性类固醇激素合成过程中扮演重要角色。为了探究性类固醇激素合成相关酶基因Srd5a1对雌性三角帆蚌卵巢发育的影响,应用RACE克隆得到了该基因全长cDNA序列,通过实时荧光定量(qRT-PCR)、原位杂交技术以及不同浓度17β-雌二醇(E2)和17α-甲基睾酮(MT)激素处理来探究基因的表达特性。结果显示,Srd5a1 cDNA全长2 224 bp,包括446 bp 5′-UTR、953 bp 3′-UTR和825 bp ORF,编码274个氨基酸。Srd5a1基因在性腺中的表达呈二态性,在卵巢中表达量更高;且在卵巢排放期的表达量最高,极显著高于其他各时期。原位杂交结果显示,Srd5a1基因在卵巢卵母细胞、卵泡以及精巢精母细胞中有表达。不同浓度E2和MT处理24 d后,Srd5a1基因的表达发生了变化。综上,Srd5a1基因可能在雌性三角帆蚌卵巢卵母细胞发育成熟和配子排放中发挥一定作用,对探索三角帆蚌性腺生长发育具有重要意义,同时为实现三角帆蚌单性化养殖提供理论参考价值。

三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我国最特殊的淡水育珠蚌之一,雄性三角帆蚌所产珍珠经济效益更

1-2。目前,三角帆蚌中并未发现异型性染色体,其性腺发育机制尚不清楚,需深入研究其性腺发育关键因子以精准地开展三角帆蚌的性别调控。

类固醇5α还原酶家族有3个成员:SRD5A1、SRD5A2和SRD5A3,分别由Srd5a1、Srd5a2Srd5a3基因编

3。90年代初,Srd5a1基因首次被ANDERSSON4克隆。该基因在不同物种之间表达模式不同,发挥不同的生物学功能。Srd5a1基因在成年老鼠卵巢、肝、脑和皮肤中有高表5;在香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)性腺中有特异表6;黑头呆鱼(Pimephales promelas)中Srd5a1基因的表达与性腺早期发育呈正显著相关,可能在其性腺早期发育过程中发挥关键作7。SRD5A1是一种位于细胞内质网膜上的微粒体蛋白,属于NADPH依赖性氧化还原酶,NADPH辅因子结合位点在类固醇5α还原酶家族中高度保守,以保证催化3-oxo-Δ4还原反应的进8。SRD5A1能将孕激素和雄激素分别催化为活性更强的孕烷和5α-二氢睾酮(5α-dihydrotestosterone,DHT),参与性别分化和性类固醇激素代谢过9。DHT除了能够诱导鱼类雄激素反应外,还能诱导雌激素反应,如促进硬骨鱼类卵巢产生17β-雌二10。RILEY11在体外将雌性罗非鱼(Oreochromis mossambicus)肝细胞暴露于100 μmol/L DHT后,发现能诱导雌激素反应蛋白卵黄蛋白原(Vtg)的释放。有报道称,无脊椎动物和脊椎动物中的SRD5As是功能同源12,但Srd5a1基因在无脊椎动物中的功能研究还不清楚。

目前,有研究者已在头足纲、双壳纲和腹足纲等软体动物中发现了性类固醇激素物质的存在。此外,有些性类固醇激素能够参与贝类生殖调控和性腺发育过

13。与脊椎动物相比,关于性类固醇激素在贝类中的合成机制及其功能研究还不系统。为了更好地了解Srd5a1基因在三角帆蚌性类固醇激素合成机制中的作用及其在雌性三角帆蚌性腺发育中的功能,本研究克隆了三角帆蚌Srd5a1基因,检测其在性腺中的表达位置,并通过17β-雌二醇(E2)和17α-甲基睾酮(MT)体外激素处理研究Srd5a1基因表达模式,为三角帆蚌性腺生长发育及其生殖内分泌机理提供参考,同时为实现三角帆蚌单性化养殖提供理论参考价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用三角帆蚌由浙江省金华市武义养殖基地提供,实验室暂养2~5 d,水温为(26±2) ℃。用微型注射器抽取12~36月龄三角帆蚌的部分性腺组织液于载玻片上,镜检辨别雌雄。分别选取12~36月龄健康的三角帆蚌雌雄各3只,4~8月龄幼蚌雌雄各6只,对其进行性腺组织取样;分别采集生长健康的24月龄雌雄三角帆蚌的7个组织:闭壳肌、斧足、外套膜、鳃、肝脏、性腺和肾脏;根据形态学观

14,将36月龄雌性三角帆蚌性腺样本分为增殖、生长、成熟、排放和休止5个时期。液氮速冻,然后放置在-80 ℃下保存备用。

1.2 石蜡切片制备和染色

取体积相同(5 mm×5 mm×5 mm)的新鲜雌雄性腺组织于4%多聚甲醛中固定2 h,实验样品设3个平行,后转入70%乙醇中4 ℃保存备用。梯度脱水,包埋浸蜡,制作厚度为6~8 μm的石蜡切片。37 ℃烘箱烘干12 h,-20 ℃保存备用。根据H.E染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)说明书进行染色,树胶封片。Leica DM 2500显微镜(Leica,德国)拍照。

1.3 总RNA提取和cDNA的合成

冷冻的性腺组织RNA按照Trizol方法提取,分别使用NanoDrop 2000C(Thermo Fisher Scientific,美国)和1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量与完整性。cDNA体外反转录根据试剂盒(RR047A-1,TaKaRa)进行。最终将其稀释5倍,于-20 ℃保存备用。

1.4 Srd5a1基因全长克隆和生物信息学分析

用Primer Premier 5.0软件进行引物设计(表1)。通过5'/3' SMARTerTM RACE cDNA试剂盒进行序列扩增,纯化的PCR产物经过连接转化和蓝白斑筛选后,由生工生物工程(上海)股份有限公司进行菌液测序。

表1  引物名称和序列
Tab.1  Primer names and sequences

引物名称

Primer name

序列5′-3′

Sequence (5′-3′)

目的

Application

Srd5a1-F1 TACATCCAGGGTGGCTTCCT 序列验证
Srd5a1-R1 AACCATCAGCTCTACCGCAG
Srd5a1-F2 ATGTCGTGCCGAGTTCTAATG
Srd5a1-R2 CGGATGTCTCCCCTGTTTTT
Srd5a1-3' ATGTGTTGGGCGAGTTGAGACT 3'克隆
qSrd5a1-F ACAGGGGAGACATCCGTGTA 荧光定量
qSrd5a1-R TGGACTGACCATGTGGCTACT
EFl-αF GGAACTTCCCAGGCAGACTGTGC
EFl-αR TCAAAACGGGCCGCAGAGAAT
I-Srd5a1-F ACAGGGGAGACATCCGTGTA 原位杂交
I-Srd5a1-R

TAATACGACTCACTATAGGG

TGGACTGACCATGTGGCTACT

1.5 荧光定量PCR分析

Srd5a1基因的ORF区设计引物,以EF1-α作为内参基因,引物序列见表1。qRT-PCR反应体系(20 μL):2× TB Green Premix Ex Taq 10 μL,RNase-free water 6.8 μL,正向和反向引物各0.8 μL,cDNA 1.6 μL。实验样品设3个平行,每个样品重复3次。CFX96 仪(Bio-Rad)检测基因相对表达量。反应程序为:95 ℃ 3 min,95 ℃ 5 s,57 ℃ 30 s,40个循环。使用2-ΔΔCt法计算Srd5a1基因的相对表达量。

1.6 原位杂交实验

引物通过Primer 5.0设计,T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAGGG)加在荧光定量下游引物5′端(表1)。用T7 High Efficiency Transcription试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司)体外转录纯化的PCR产物,标记探针通过DIG RNA Labeling Mix(Roche,德国)获得后储存于-80 ℃。原位杂交按照Enhanced Sensitive ISH Detection kit Ⅱ,AP试剂盒(Boster,USA)进行。Leica DM 2500显微镜(Leica,德国)观察杂交信号并进行拍照。

1.7 不同浓度17β-雌二醇和17α-甲基睾酮浸泡实验

实验采用乙醇溶解激素后直接浸泡的方法进行,激素为17β-雌二醇(17β-Estradiol,E2)和17α-甲基睾酮(17α-Methyltestosterone,MT),得到的浓度40 ng/L和200 ng/L参考PUINEAN

15。选取壳长为8~11 cm的12月龄健康雌性三角帆蚌,随机分为5组:空白对照组(0 ng/L)、17β-雌二醇低浓度实验组(40 ng/L)和高浓度实验组(200 ng/L)、17α-甲基睾酮低浓度实验组(40 ng/L)和高浓度实验组(200 ng/L),每组30只,浸浴1、3、6、12、18和24 d。每天定时换水换液,确保水体中激素浓度直至相应取样时间点,并投喂新鲜的小球藻保证营养。在每个时间点,从每组中随机选择5只进行性腺组织取样,液氮速冻后存于-80 ℃备用。

2 结果

2.1 三角帆蚌Srd5a1基因的序列分析

三角帆蚌Srd5a1基因 cDNA全长为2 224 bp(登录号:OP750480),包括446 bp 5′-UTR、953 bp 3′-UTR和825 bp ORF,共编码氨基酸274个(图1)。将三角帆蚌Srd5a1基因氨基酸序列在NCBI中进行比对。结果显示,三角帆蚌Srd5a1基因与鳞角腹足蜗(Gigantopelta aegis)的同源性为53.3%;与红鲍(Haliotis rufescens)和澳洲鲍鱼(Haliotis rubra)的同源性分别为52.67%和52.63%(图2)。

图1  Srd5a1 cDNA序列及其编码的氨基酸序列

Fig.1  Srd5a1 cDNA sequence and encoded amino acid sequence

起始密码子和终止密码子用黑色方框框出;绿色方框内为NADPH绑定域;红色方框内为非规范聚腺苷酸化信号。

The black box showed the start and stop codons; The green box showed the NADPH binding domain; The red box showed the non-canonical polyadenylation signal.

图2  Srd5a1氨基酸的多序列比对

Fig.2  Multiple comparisons of Srd5a1 amino acid

2.2 Srd5a1基因在24月龄雌雄三角帆蚌各组织中的表达分析

组织定量结果表明,Srd5a1基因在7个组织中均有表达。其中,Srd5a1基因在性腺中存在差异性表达,卵巢中的表达量极显著高于精巢(P<0.01);在鳃和斧足组织中表达较高,在外套膜中表达最低(图3)。

图3  Srd5a1基因在24月龄雌雄三角帆蚌各组织中的表达

Fig.3  Expression of Srd5a1 in different tissues of 24-month-old male and female H.cumingii

**表示雌雄间差异极显著(P<0.01)。

** indicates highly significant differences between males and females (P<0.01).

2.3 Srd5a1基因在幼蚌和成年蚌性腺组织中的表达分析

与12月龄性腺组织表达相比,Srd5a1在性腺早期发育阶段(4~8月龄)的整体表达水平较低,呈现先下降后上升再下降的波动性变化,其在5月龄和8月龄的表达量相对较低,与其他各月龄存在显著差异(图4)。在12~36月龄性腺组织中,Srd5a1 mRNA表达呈现二态性,在12和24月龄卵巢中的表达极显著高于精巢(P<0.01),在36月龄精巢中表达量最高(图5)。

图4  Srd5a1 mRNA在4~8月龄性腺组织中的表达

Fig.4  Expression of Srd5a1 mRNA in the gonads of 4-8 months old

图中字母不同代表各月龄之间存在显著性差异。

Different letters in the graph represent significant differences between months of age.

图5  Srd5a1 mRNA在12~36月龄性腺组织中的表达

Fig.5  Expression of Srd5a1 mRNA in the gonads of 12-36 months old

*表示卵巢和精巢间差异显著(P<0.05);**表示卵巢和精巢间差异极显著(P<0.01)。

* indicated significant difference between ovary and testis (P<0.05); ** indicated significant difference between ovary and testis (P<0.01).

2.4 Srd5a1基因在雌性三角帆蚌卵巢不同发育时期中的表达分析

Srd5a1基因在卵巢整个发育过程中均有表达,其表达量呈现先上升后下降的趋势。随着卵母细胞体积增大,数目增多,Srd5a1基因的表达显著上调,并在配子排放时达到峰值,配子排放后滤泡开始萎缩,Srd5a1基因的表达迅速下降至最低值(图6)。

图6  Srd5a1 mRNA在卵巢不同发育时期中的表达

Fig.6  Expression of Srd5a1 mRNA in different developmental periods of the ovary

图中不同的字母代表不同时期之间差异具有显著性。

Different letters in the graph represent significant differences between periods.

2.5 Srd5a1基因在性腺中的定位结果

Srd5a1 mRNA在卵巢卵母细胞细胞质以及卵泡上有强烈的阳性信号,且随着卵母细胞卵黄的积累,其阳性信号更为强烈;在精巢精母细胞中检测到其微弱的阳性信号(图版)。

  

1.精巢空白组;2.精巢实验组;3.卵巢空白组;4.卵巢实验组;紫色为阳性信号。Sp.精子; Sc.精母细胞; Fc.卵泡; Oc.卵母细胞; Og.卵原细胞; Nu.细胞核。

1. Testis blank control group; 2. Testis experimental group; 3. Ovarian blank control group; 4. Ovarian experimental group; Purple color is the positive signal. Sp. Sperm; Sc. Spermatocyte; Fc. Follicles; Oc. Oocyte; Og. Oogonium; Nu. Nucleus.

图版 Srd5a1 mRNA在雌雄性腺中的表达定位

Plate Localization of Srd5a1 mRNA expression in male and female gonads

2.6 不同浓度17β-雌二醇和17α-甲基睾酮浸泡雌性三角帆蚌Srd5a1基因的表达分析

用不同浓度的激素处理24 d,结果显示:在低浓度40 ng/L E2处理条件下,第1天,Srd5a1基因表达迅速上升,在处理6 d后其表达量出现极显著下降,第12天时,回升至正常水平;第18天时,出现显著性下降;第24天时,又回升至正常水平,Srd5a1基因的表达变化规律以6 d为1个周期。在高浓度200 ng/L E2处理条件下,第1~3天,Srd5a1基因表达显著性下降,第6~18天,其表达量开始回升,显著高于空白对照组;第24天时,Srd5a1基因的表达回落至较低水平(图7)。

图7  不同浓度17β-雌二醇处理下Srd5a1基因在卵巢中的表达

Fig.7  Expression of Srd5a1 gene in ovary treated with E2 at different concentrations

*表示显著差异(P<0.05);**极显著差异(P<0.01)。

* indicates significant differences (P<0.05); ** indicates highly significant differences (P<0.01).

在低浓度40 ng/L MT处理条件下,Srd5a1基因的表达只在第1天有显著性升高,其他各时间点处,该基因表达量没有显著变化。高浓度200 ng/L MT处理24 d,Srd5a1基因的整体表达水平出现显著性下降(图8)。

图8  不同浓度17α-甲基睾酮处理下Srd5a1基因在卵巢中的表达

Fig.8  Expression of Srd5a1 gene in ovary treated with MT at different concentrations

*表示显著差异(P<0.05);**表示极显著差异(P<0.01)。

* indicates significant differences (P<0.05); ** indicates highly significant differences (P<0.01).

3 讨论

SRD5A有3种分别由Srd5a1基因、Srd5a2基因和Srd5a3基因所编码的同工

3,作为性类固醇激素合成过程中的重要催化酶,在性腺发育、性别分化及激素生理中发挥重要作用。SRD5A的同系物已在人16、大5、鸟17、青18和鱼19等脊椎动物中被报道,在香港牡蛎(Magallana hongkongensis6和光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata20等软体动物中也被鉴定出来。RAMOS21克隆的仓鼠Srd5a1基因的3'非翻译区包括两个非规范聚腺苷酸化信号,本研究通过首次克隆三角帆蚌Srd5a1 cDNA序列全长以及生物信息学分析揭示其3'非翻译区也包括两个非规范聚腺苷酸化信号,分别为AATTAA和AGTAAA;近端5'侧翼序列处有真核生物转录所需的TATA和CCAT box3。仓鼠中Srd5a1基因编码的氨基酸包括NADPH结合域:GETGYKIPRGG21;鳗鱼(Anguillidae)中Srd5a1基因编码的氨基酸含有NADPH结合域:GETGYKIPVGG3;三角帆蚌中Srd5a1编码的氨基酸也含有NADPH结合域:GETSVYKIPRGG(GXXXXXXXXGG),不同物种中该区域比较保守,为Srd5a1基因能够参与性类固醇激素合成的还原反应提供保证。多重序列比对结果显示,三角帆蚌Srd5a1基因的氨基酸序列与无脊椎动物相似度较高,证明Srd5a1基因在进化过程中相对保守。

芮彩

22发现Srd5a1基因在生物机体各个组织中广泛分布,如肾上腺、肝脏、肾脏、皮肤以及神经和免疫等非性类固醇激素依赖组织。Srd5a1基因在24月龄雌雄三角帆蚌7个组织中均有表达,表明三角帆蚌7个组织均可合成SRD5A1并发挥其生物学功能。其中,Srd5a1基因在三角帆蚌性腺中的表达呈二态性,在卵巢中的表达量更高。据报道,Srd5a1基因在成年日本鳗鲡(Anguilla japonica3、大5、香港牡6卵巢中的表达水平较高;此外,洪23通过干扰黔北麻羊Srd5a2,发现黔北麻羊的卵巢颗粒细胞的增殖受到抑制。由此推测,Srd5a1基因可能在雌性三角帆蚌性腺发育过程中发挥一定作用。在性腺发育早期5—7月龄,三角帆蚌原始生殖细胞数量逐渐增多,形态逐渐规24Srd5a1基因的表达出现显著性上升;当7—8月龄,性腺开始分化后,其表达出现显著下降,推测Srd5a1基因可能在三角帆蚌早期性腺发育中发挥关键作用。Srd5a1基因在三角帆蚌卵巢不同发育阶段表达变化显著,随着卵母细胞数量逐渐增多,体积逐渐增大,Srd5a1基因的表达量逐渐升高;在配子排放之际,其表达量达到峰值;排放期过后卵泡逐渐萎缩,Srd5a1基因的表达量出现显著性下降,由此说明,Srd5a1基因可能与卵母细胞的发育和配子排放密切相关。Srd5a1基因在12、24、36月龄性腺中的表达呈二态性,在24月龄中卵巢的表达量低于12月龄和36月龄卵巢,可能由于24月龄正处于性成熟阶25,卵巢可能处于增殖期的原因;Srd5a1基因在36月龄的表达水平最高,可能由于36月龄性腺已完全成熟,卵巢处于排放期的原因。原位杂交结果显示,Srd5a1基因主要在卵巢卵母细胞的细胞质和卵泡中出现阳性信号,且阳性信号随着卵母细胞卵黄颗粒的积累越强烈,在精巢精母细胞检测到越微弱的阳性信号,推测Srd5a1基因可能在三角帆蚌卵母细胞的成熟、卵泡结构和精巢精母细胞发育中发挥作用。

近年来,外源性类固醇激素能够影响水生生物性腺发育的相关报道越来越多。有研

26表明,外源性类固醇激素可诱导人工养殖鱼类性腺发育成熟和排卵。另有研究发现外源性类固醇激素刺激贝类后可发生性逆转现象。E2作为活性最强的雌激素,参与鱼类、两栖类和爬行类等低等脊椎动物性别决定与分化、性腺发育过程,与人和小鼠等哺乳动物卵泡发育也有密切联27。MORI28最早提出E2可影响双壳类的性别分化,在季节性性成熟早期阶段,将E2注射到太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)体内,发现雄性逆转为雌性。用E2处理北极贝(Spisula sachalinensis29、福建牡蛎(Crassostrea angulata30、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis31、太平洋牡28、黑唇珍珠牡蛎(Pinctada margaritifera32等贝类后,可以促进其卵巢发育和配子发生过程。本研究利用不同浓度E2处理雌性三角帆蚌24 d发现,40 ng/L E2 处理6 d后,其卵巢中Srd5a1基因的表达受到极显著抑制。这与雌二醇处理非洲爪蟾(Xenopus laevis)6 d后,其精巢中Srd5a1基因的表达受到显著抑制结果类33。由此说明,在短期处理下,Srd5a1基因对E2的作用十分敏感。200 ng/L E2处理下,Srd5a1基因前期表达受到抑制,后期表达上调,可能随着时间推移,高浓度的E2不断涌入雌性三角帆蚌体内,内源性类固醇激素平衡状态被打破,需要Srd5a1基因高度表达进行补偿。由此推测E2可能通过影响Srd5a1基因的表达水平来调节三角帆蚌内源性类固醇激素的合成,从而参与卵巢发育和配子发生过程。除了雌激素能影响卵巢分化,调控卵母细胞发育成熟外,雄激素也参与雌性生物的生殖功能。11-酮基睾酮(11-ketotestosterone,11-KT),鱼类特异性雄激素,可调控澳洲鳗鲡(Anguilla australis)卵黄卵母细胞发34;雌性斑马鱼的雄性受体被敲除后,雄激素不能与相应受体结合发挥生物学功能,使得卵巢的大小和质量都有所下35。此外,MT已在斑马鱼(Danio rerio)中被证实有雌激素和雄激素效36,MT能够抑制雌性麦穗鱼(Pseudorasbora parva)卵巢的发育并使之退37。本研究通过不同浓度MT处理雌性三角帆蚌24 d后发现,Srd5a1 mRNA的表达在40 ng/L MT处理下没有明显效果,仅在第1天有显著性上调,可能是应激反应导致;200 ng/L MT处理下,Srd5a1基因的整体表达水平受到抑制,可能由于外源雄激素不断涌入,三角帆蚌卵巢内源雄激素需求降低,Srd5a1 mRNA表达被抑制。由此说明,Srd5a1基因在雌性三角帆蚌性类固醇激素合成过程中发挥重要作用,MT可能通过负调控Srd5a1基因的表达对卵巢卵母细胞生长成熟以及卵巢发育产生影响。

综上所述,本研究首次从三角帆蚌中克隆了性类固醇激素合成相关酶基因Srd5a1。通过研究其表达特性,发现Srd5a1基因可能与雌性三角帆蚌卵巢发育、成熟以及配子排放密切相关;利用不同浓度外源雌雄激素处理雌性三角帆蚌后,发现Srd5a1基因参与三角帆蚌内源性类固醇激素的合成过程,外源激素可能通过正负调控Srd5a1基因的表达影响雌性三角帆蚌的性腺发育过程。研究结果为三角帆蚌性腺生长发育及其生殖内分泌机理提供参考,同时为实现三角帆蚌单性化养殖提供理论参考价值。

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