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杀鱼爱德华氏菌新型抗酸系统GadBCD的抗酸作用与致病作用  PDF

  • 高博 1,2
  • 宫春光 1
  • 舒艾梅 1,2
  • 张杉杉 1,2
  • 李静林 1,2
  • 胡永华 2,3
1. 河北农业大学 海洋学院,河北 秦皇岛 066000; 2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南 海口 571101; 3. 海南省海洋生物资源功能性成分研究与利用重点实验室,海南 海口 571101

中图分类号: S 941.4

最近更新:2024-01-29

DOI: 10.12024/jsou.20221204042

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摘要

本研究鉴定了鱼类重要致病菌杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)抗强酸系统GadBCD及其功能。通过序列分析和共转录实验表明:GadBCD系统由1个谷氨酸脱羧酶、1个谷氨酰胺酶和3个转运体组成,它们组成1个操纵子。 qRT-PCR发现强酸和高温刺激细菌时gadBCD表达基本不变,但过氧化氢和宿主血清刺激时gadBCD表达显著上调。利用同源重组构建了GadBCD系统缺失突变株ΔgadP,通过比较野生株和ΔgadP的生长曲线以及酸性压力下存活率等实验,发现GadBCD系统不仅是杀鱼爱德华氏菌抗中强酸的重要参与者,也是抗强酸所必需的;通过比较野生株和ΔgadP在生物膜形成、运动性、抗宿主血清杀伤、感染细胞等方面的差异,发现GadBCD参与了细菌的毒力。综上所述, GadBCD系统是杀鱼爱德华氏菌重要的抗强酸系统,并参与了细菌的致病作用。

杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)爱德华氏菌属(Edwardsiella),曾又称迟缓爱德华氏菌(E. tarda)。 ABAYNEH

1在2013年重新分类鱼源迟缓爱德华氏菌菌株时,将其更名为杀鱼爱德华氏菌。该菌形似短杆状,是一种革兰氏阴性、无荚膜、兼性厌氧、具有运动能力的胞内2。杀鱼爱德华氏菌广泛分布于环境中,对多种动物具有致病性,但其主要感染对象为鱼类,包括罗非鱼(Oreochromis mossambicus)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)等 3。鱼体被其感染后引发爱德华氏菌病,该病典型症状包括但不限于鱼体表面因色素沉着差异而色泽不一、皮肤有轻微至中度的溃疡、眼球浑浊且突出、体表及部分内脏出血、腹胀以及螺旋游动4。杀鱼爱德华氏菌的致病性是多元化的,多个毒力因子/系统被鉴定,其致病作用与机制被阐析。随着研究的深入,杀鱼爱德华氏菌已逐渐成为一个在分子和细胞水平上研究水产病原菌的毒力机制、毒力因子与宿主互作的模式菌株。已有的研究表明杀鱼爱德华氏菌感染鱼类主要分为以下几个阶段:首先,细菌凭借鞭毛产生的运动性游动至宿主附5,并利用黏附素如非菌毛血凝素和鞭毛蛋白等附着于鱼体体表、胃肠道和6;接着,利用溶血素等入侵素类似的蛋白侵袭感染宿主组织或者细7;随后,借助Ⅲ型分泌系统(T3SS)和Ⅵ型分泌系统(T6SS)等毒力系统/因子逃避宿主免疫杀伤,并通过对抗逆因子和毒力因子的表达调控来适应胞内环8;最后,在细胞内存活的细菌大量增殖,释放后感染其他细胞。虽然近年来杀鱼爱德华氏菌致病机制有积极进展,但是其耐强酸机制还未见有研究报道。

病原菌经常不可避免会遇到各种各样的环境压力,如高温、高渗透压、氧化应激、pH波动、饥荒等。在这些环境压力中,低pH往往是病原体最常见的困

9。酸性环境包括酸性土壤、发酵食品、胃肠道强酸环境以及细胞巨噬细胞吞噬体中的中度酸环10。为了对抗细胞内和细胞外的酸胁迫,细菌已经进化出了被动和主动的酸性耐受机11。在这些机制中,氨基酸依赖性抗酸系统(AR)是大部分细菌共有的抗酸系统,它由一个催化底物氨基酸的质子依赖性脱羧化的细胞质脱羧酶和一个用外部底物交换内部产物的内膜底物/产物逆向转运蛋白组12。在大肠杆菌中,已鉴定的AR系统包括谷氨酸脱羧酶系13、精氨酸脱羧酶系14、赖氨酸脱羧酶系15以及鸟氨酸脱羧酶系16。这些系统分别在不同酸强度下起主要抗酸作用,保护细菌免受各种酸胁迫的危害。

谷氨酸依赖型抗酸系统主要是利用谷氨酸脱羧酶催化的脱羧反应消耗H+,从而提高胞内的pH,所以该系统又称谷氨酸脱羧酶系统,是目前研究最为广泛的细菌抗酸应激系统。目前已在弗氏志贺菌(Shigella flexneri

17、乳酸菌(Lactobacillus18、布鲁氏菌(Brucella19、大肠杆菌(Escherichia coli20以及单增李斯特菌(Listeria monocytogenes21等多种细菌中鉴定了谷氨酸脱羧酶系统并阐明了其抗酸作用,特别是抗强酸作用。对于大肠杆菌和单增李斯特菌来说,谷氨酸脱羧酶系统是其最重要的强酸耐受机制。该系统主要由谷氨酸脱羧酶和氨基酸逆向转运蛋白2个组分组成。谷氨酸脱羧酶(Glutamic acid decarboxylase ,GAD)是一种典型的依赖于磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5′-phosphate,PLP)的Ⅱ类氨基酸脱羧酶,可以催化谷氨酸脱羧形成γ-氨基丁酸和二氧化碳,并伴有质子消22-23; 氨基酸逆向转运蛋白(GadC)可转运谷氨酸、谷氨酰胺和γ-氨基丁酸。GadC是一种依赖pH的逆向转运蛋白,在pH<5.5时具有强活性,而在pH≥6.5时无转运活24

在前期研究中,我们鉴定了杀鱼爱德华氏菌抗弱酸系统CadBA

25。在本研究中,我们鉴定了杀鱼爱德华氏菌一个新型的抗强酸系统GadBCD,明确了其抗强酸作用、对细菌生理性能的影响以及在细菌致病过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及质粒

杀鱼爱德华氏菌(E. piscicida TX01)分离自患病的鱼

26,由中国科学院海洋研究所提供; E. coli DH5α购买自北京全式金生物技术股份有限公司;pDM4质粒由中国科学院海洋研究所提供。

1.1.2 培养基及实验细胞

LB培养基(g/L):胰蛋白胨 10、酵母提取物5、NaCl 10,pH 为9.0、7.0、5.0、4.5、4.2、3.0和2.5等。牙鲆腮细胞系(FG 细胞)和小鼠巨噬细胞(RAW264.7 细胞)由中国科学院海洋研究所馈赠。

1.1.3 试剂与引物

酵母浸粉、胰蛋白胨购自Oxoid公司;T4连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司;质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、RNA提取试剂盒购自OMEGA公司;琼脂粉、多黏菌素B、氯霉素和氨苄青霉素购自北京索莱宝科技有限公司;逆转录试剂盒购自Invitrogen公司;DMEM细胞培养液购自Corning公司;L-15细胞培养液购自吉诺生物工程有限责任公司;胎牛血清、胰蛋白酶购自Thermo Fisher公司;PBS缓冲液、PCR Master MIX购自生工生物工程(上海)股份有限公司; qPCR Super MIX购自北京全式金生物技术股份有限公司。本研究所用引物见表1,由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1  引物序列
Tab.1  Primers sequence
引物 Primer引物序列(5'-3') Sequence (5'-3')用途 Function
GadPKOF1 ggatccATGTTGGGCTTATCCACCGA (BamHⅠ) 基因敲除
GadPKOR1 TAGCGTTACGGCGCATAACGACG 基因敲除
GadPKOF2 ATGCGCCGTAACGCTAACTAATAGATAAGAA 基因敲除
GadPKOR2 ggatccCAACATCCTGGCGCTGAA (BamHⅠ) 基因敲除
GadPKOF3 GCCTCTGAACCAAAGCG 基因敲除
GadPKOR3 CCGTTCGGGTACGATGT 基因敲除
GadC3-GadC2RTF CGGGGGACAAAACATCGACA RT-qPCR
GadC3-GadC2RTR CTGGTGATGCTGCTGGTGAT RT-qPCR
GadC2-GadDRTF CAAAGACAAAGGCCAGCCAG RT-qPCR
GadC2-GadDRTR GAAAAATGGTGGCGGACGTC RT-qPCR
GadD-GadCRTF GGCCAGCGTCGCATACTG RT-qPCR
GadD-GadCRTR GGCCCAGGCACAGCAGA RT-qPCR
GadC-GadBRTF CTGACCACCGCGACGATAT RT-qPCR
GadC-GadBRTR CCAGCTGCTGATGGAGGACTT RT-qPCR
ETAE-2863RTF GGTAACTGTAGCACGGCCA RT-qPCR
ETAE-2863RTR GTCACCATAATGATCGGCATC RT-qPCR
ETAE-2869RTF TTTATGATCGATCGCAGCAA RT-qPCR
ETAE-2869RTR GCATCAGAAAGCGAAAGTGTT RT-qPCR

1.2 方法

1.2.1 GadBCD系统生物学信息分析

在NCBI数据库中获取杀鱼爱德华氏菌GadBCD系统5个蛋白(GadB、GadD、GadC、GadC2和GadC3)的氨基酸序列,用DNAMAN 5.0 软件对该系统5个蛋白的氨基酸序列进行比对分析;用在线软件对5个蛋白质的理化性质、跨膜结构、保守结构域和三维结构等进行在线预测分析。

1.2.2 GadBCD系统共转录验证

将杀鱼爱德华氏菌TX01接种于 LB 液体培养基中,28 ℃ 培养至OD600=0.8;离心收集菌体,用细菌基因组DNA提取试剂盒和HP Total RNA kit分别提取基因组DNA(gDNA)和总RNA,RNA 反转录cDNA。分别以cDNA、gDNA和RNA(阴性对照)为模板,用特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系:模板1 μL、引物F/R 0.5 μL、2×PCR Mix 6.25 μL、加超纯水至20 μL。反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃ 5 min。实验重复3次。

1.2.3 GadBCD系统在逆境条件的表达

将培养至对数期的杀鱼爱德华氏菌TX01在 pH 2.5 、42 ℃、血清和过氧化氢的条件下刺激1 h,提取总RNA反转cDNA,进行 RT-qPCR 检测基因的表达。RT-qPCR 反应体系(20 μL):SYBR® Premix Ex Taq™ 10 μL,特异性引物对各0.5 μL,100倍稀释的 cDNA 2 μL,超纯水 7 μL。RT-qPCR反应条件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,40个循环;72 ℃ 20 s。采用 2-ΔΔCt法计算GadBCD 系统的表达水平,16S rDNA 作为内参基因。实验重复3次。

1.2.4 GadBCD系统的敲除

由于GadBCD系统所属的5个基因阅读框过长,难以进行缺失突变,因而我们考虑缺失GadBCD系统启动子区域209 bp的一段序列。引物的核苷酸序列见表1。为获得同源重组序列,分别使用引物GadPKOF1/ GadPKOR1和GadPKOF2/ GadPKOR2扩增缺失区的侧翼片段,再利用引物GadPKOF1/ GadPKOR2融合侧翼片段。将融合片段克隆到自杀质粒pDM4的BamHⅠ位点,获得重组质粒命名为pDMGadP。将重组质粒pDMGadP结合转移到野生株TX01中,在含有10%蔗糖的LB琼脂平板上筛选缺失敲除株,经抗性验证和测序验证确定敲除株,命名为ΔgadP。

1.2.5 敲除株ΔgadP中gadBCD表达水平检测

提取野生株TX01和敲除株ΔgadP总RNA,反转录为cDNA,通过RT-qPCR检测gadBCD的表达水平,以确认敲除株ΔgadP中gadBCD不表达或超低水平表达。

1.2.6 GadBCD系统对细菌生长的影响分析

将对数期的野生株和敲除株ΔgadP稀释至105接种在不同pH(7.0~4.2)酸性条件的LB培养基,利用Bioscreen C生长测定仪监测细菌的生长情况。每组样品3个平行,实验重复3次。

1.2.7 GadBCD系统对细菌在强酸条件存活的影响分析

将对数期的野生株和敲除株稀释100倍,在pH=7、pH=2.5和pH=2.5且添加1 mmol/L Glu 3种条件下的PBS缓冲液中孵育2 h,细菌经系列梯度稀释后涂布在含有polyB的LB平板上进行菌落计数。实验重复3次。

1.2.8 GadBCD系统对细菌生物膜形成和运动性的影响分析

细菌生物膜形成能力的检测采用结晶紫染色法,具体方法参考MA

27的方法:细菌在LB培养基中培养至对数期,离心收集菌体,用PBS清洗菌体3遍,并用LB培养基稀释重悬至终浓度为1×105 CFU/mL;将稀释好的菌液加入96孔板中,每孔200 μL,每个菌株6个平行孔,只加LB培养基的孔作为空白对照,28 ℃培养箱中培养24 h;将96孔板中的菌液吸出,使用PBS洗孔3遍,晾干后每孔加入200 μL Bouin 氏液室温固定1 h;将Bouin 氏液吸出,使用PBS洗孔3遍,自然晾干后每孔加入200 μL 1%的结晶紫染色液,室温染色30 min;将结晶紫染色液吸出,使用无菌PBS洗孔3遍,自然晾干后每孔加入200 μL甲醇溶液,室温溶解20 min;使用酶标仪测定OD570,实验重复3次。

细菌运动性分析参考HUO

28的方法:细菌在LB培养基中培养至对数期, 将培养好的菌液原液1 μL分别滴到半固体平板两侧,设多个平行对照,28 ℃培养箱培养24 h;测量拍照使用直尺测量运动圈的直径,并用相机拍照记录,实验重复3次。

1.2.9 GadBCD系统对细菌致病性的影响分析

细菌对牙鲆FG 细胞的黏附和侵染实验参考JIN

29的方法:野生株TX01和敲除株ΔgadP在 DMEM培养基中培养至对数期,按MOI=10∶1(细菌数量与细胞数量之比)的比例感染牙鲆FG细胞1 h和2 h;感染完后细胞用PBS冲洗3次,再用1% Triton X-100裂解细胞;裂解液经系列梯度稀释后,涂布在含有polyB的LB平板上进行菌落计数。每组样品3个平行,实验重复3次。

细菌在RAW264.7细胞中的增殖按XIE

30的方法:细菌在DMEM培养基中培养至对数期,按MOI=10∶1(细菌数量与细胞数量之比)的比例与RAW264.7细胞孵育;2 h后用PBS冲洗3次,用含有200 μg/mL庆大霉素的DMEM继续培养2 h以杀灭胞外细菌,然后用含有10 μg/mL庆大霉素的DMEM培养基培养细胞0、2、4和6 h;加1% Triton X-100裂解细胞,裂解液经系列梯度稀释后,涂布在含有polyB的LB平板上进行菌落计数。实验重复3次。

细菌在罗非鱼血清的存活率实验按FANG

31的方法:细菌在LB培养基中培养至对数期,离心收集菌体,用无菌PBS清洗菌体3遍并稀释重悬至终浓度1×105 CFU/mL;将稀释后的菌液各取50 μL,分别各自加入50 μL血清或50 μL无菌PBS(对照组),设3个平行,吹打混匀,置于室温下孵育1 h;涂布在含有 polyB 的 LB 平板上进行菌落计数。实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 杀鱼爱德华氏菌GadBCD系统生物学信息分析

前期在对杀鱼爱德华氏菌抗酸性能研究中,鉴定了1个抗弱酸系统CadBA。然而杀鱼爱德华氏菌抗强酸系统还完全未知。通过分析杀鱼爱德华氏菌基因组序列,我们发现了1个疑似谷氨酸脱羧系统,命名为GadBCD。GadBCD系统由GadB、GadC、GadD、GadC2和GadC3共5个蛋白组成。GadB(ETAE_2868)开放阅读框(ORF)由1 395 bp组成,编码464个氨基酸,与大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶GadB具有79%的一致性,具有脱羧酶的保守结构域,三维结构呈六聚体(图1a)。GadC(ETAE_2867)开放阅读框(ORF)由 1 581 bp 组成,编码526个氨基酸,与大肠杆菌的转运蛋白GadC具有32%的一致性,具有氨基酸通透酶保守结构域,三维结构呈单体(图1b)。GadD(ETAE_2866)开放阅读框(ORF)由 936 bp 组成,编码311个氨基酸,与大肠杆菌的谷氨酰胺酶YbaS具有84.57%的一致性,具有谷氨酰胺酶的保守结构域,三维结构呈二聚体(图1c)。GadC2 (ETAE_2865)开放阅读框(ORF)由1 302 bp组成,编码433个氨基酸,与大肠杆菌的转运蛋白GadC具有71.79%的一致性,具有氨基酸转运蛋白的保守结构域,三维结构呈单体(图1d)。GadC3(ETAE_2864)开放阅读框(ORF)由 648 bp 组成,编码215个氨基酸,与大肠杆菌的MarC家族蛋白具有67.79%的一致性,具有MarC家族保守结构域,为多次跨越质膜的未知功能蛋白质且三维结构呈单体(图1e)。

图1  杀鱼爱德华氏菌GadBCD系统5个组成的结构域分析与三维结构预测

Fig.1  Structural domain analysis and tertiary sgructure prediction of E. piscicida GadBCD system

2.2 GadBCD系统共转录验证

在许多细菌如大肠杆菌和单增李斯特菌中,gadBgadC在1个操纵子下进行共转录,以快速的应对胞内外强酸压力。在E. piscicida中,gadC3和gadC2之间有1个15 bp的基因重叠区,gadC2和gadD之间有1个6 bp的基因间隔区,gadDgadC之间有1个76 bp的基因间隔区, gadCgadB之间有1个37 bp的基因间隔区(图2a)。为了验证这些基因的共转录关系,分别在gadB 3'末端与gadC 5'末端、gadC 3'末端与gadD 5'末端、gadD 3'末端与gadC2 5'末端、gadDC2 3'末端与gadC3 5'末端设计了4对引物,以细菌总RNA、cDNA和gDNA为模板进行了PCR反应。结果显示,在cDNA和gDNA为模板的反应体系中,4对引物均扩增出了目的条带,而在RNA中未扩增出任何条带(图2b)。这些结果表明gadBgadCgadD、gadC2和gadC3在1个操纵子下进行共转录。此外,在gadB和ETAE_2869之间预测到启动子区Pgad图2a)。

图2  杀鱼爱德华氏菌GadBCD操纵子示意图和共转录验证

Fig.2  Schematic organization and co-transcriptional verifcation of the GadBCD operon in E. piscicida

S1和S2表示预测的2个转录起始位点,F和R为引物。

S1 and S2 denote the predicted transcription start site, F and R are primers.

上述结果表明,杀鱼爱德华氏菌GadBCD系统由5个蛋白组成,且谷氨酸脱羧酶和谷氨酰胺酶连同3个转运蛋白组成同1个操纵子。与其他细菌谷氨酸脱羧系统相比,杀鱼爱德华氏菌GadBCD系统具有组成的独特性和新颖性。

2.3 GadBCD系统表达与酸性环境的关系

在酸性压力环境下细菌抗酸基因往往诱导表达。为探究GadBCD表达是否受外界环境的影响,将杀鱼爱德华氏菌在酸压力、氧化压力、宿主血清和高温等逆境条件下刺激1 h,RT-qPCR分析刺激前后GadBCD表达水平。由于GadBCD系统内各个基因是共转录关系,选择检测gadB的表达来替代GadBCD的表达水平。结果显示,相比于正常条件下,gadB表达在强酸和高温刺激下基本不变,而在过氧化氢和血清刺激时分别上调了7倍和5倍(图3a)。上述结果表明GadBCD 系统在酸性条件下是组成型表达,而非诱导型表达。

图3  GadBCD系统表达分析

Fig.3  Expression of GadBCD system

(a)逆境条件下gadBCD的表达分析;虚线代表pH = 7为对照组;(b)ΔgadP中gadBCD、ETAE_2863和ETAE_2869的表达分析;虚线代表野生株的表达为对照组。

(a)The gadBCD expression of TX01 under different adversity. Dashed line represents control(pH = 7);(b) The expression of gadBCD, ETAE_2863 and ETAE_2869 in ΔgadP. Dashed line represents the expression of the wild strain as a control.

2.4 GadBCD系统的敲除

框内基因缺失是研究基因功能的首选方法,考虑到GadBCD系统有5个基因组成,且全长有5 962 bp,全部基因的缺失难以获得。为此,我们缺失了GadBCD系统上游启动子209 bp区域,获得的敲除株命名为ΔgadP。为验证敲除后的效果,RT-qPCR比较了野生株和敲除株GadBCD系统表达的差异。结果显示,与野生株相比,敲除株ΔgadP中gadBCD的表达下调约1 200倍,而GadBCD系统邻近的上下游基因ETAE_2863和ETAE_2869的表达不变(图3b)。这些结果表明我们成功构建了GadBCD系统的敲除株。

2.5 GadBCD系统与细菌抗中强酸的关系

为探明GadBCD系统是否在杀鱼爱德华氏菌抗酸过程中起作用,我们将野生株TX01和敲除株ΔgadP在不同酸性环境下生长(4.2 < pH ≤7.0),并检测细菌的生长状况。结果表明,在中性pH,即pH = 7.0时,野生株TX01和敲除株ΔgadP的生长一致(图4a);当生长环境的pH下降至5.0和4.5时,敲除株的生长在对数期稍微滞后于野生株(图4b和4c);当pH下降至4.2时,敲除株ΔgadP无法生长,而野生株依旧正常生长(图4d)。结果表明,GadBCD系统的失活使杀鱼爱德华氏菌失去了在中强酸环境下的生长能力。

图4  杀鱼爱德华氏菌在不同条件下的生长状态

Fig.4  Growth analysis of E. piscicida in diferent conditions

2.6 GadBCD系统与细菌抗强酸的关系

为明确GadBCD系统是否在杀鱼爱德华氏菌抗强酸过程中起作用,我们将对数期的野生株TX01和敲除株ΔgadP在强酸(pH=2.5)的环境中挑战2 h,然后检测存活的细菌。结果表明,野生株TX01的存活率为8.3%,而敲除株ΔgadP的存活率仅为0.5%,显著低于野生株(图5)。表明GadBCD系统的缺失显著削弱了杀鱼爱德华氏菌对强酸逆境的耐受。当外源添加1 mmol/L Glu,相比于未添加Glu的条件,野生株TX01存活率极显著上升 (8.3%上升到77.2%),说明该菌可利用外源Glu来抵御强酸。而对于敲除株ΔgadP,添加与未添加Glu,存活率没有发生显著变化,维持在0.6%左右(图5),说明敲除株无法利用外源性Glu抵御强酸环境。上述结果表明杀鱼爱德华氏菌通过GadBCD系统介导的Glu利用来获得抵御强酸性能,GadBCD是杀鱼爱德华氏菌主要的抗强酸系统。

图5  酸性条件下的存活率

Fig.5  Survival rate under acid condition

2.7 GadBCD系统对细菌生物膜形成和运动性的影响

在明确GadBCD系统与杀鱼爱德华氏菌耐酸性能的关系后,我们继续探究该系统是否与细菌其他性能如生物膜形成和运动性相关。为此,利用结晶紫染色(CV)法检测了杀鱼爱德华氏菌生物膜的形成。结果显示,敲除株ΔgadP 的生物膜形成能力明显强于野生株TX01(图6a)。这表明GadBCD系统的缺失增强了杀鱼爱德华氏菌的生物膜形成能力。

图6  GadBCD突变对生物膜形成和运动性的影响

Fig.6  Effects of GadBCD mutations on bioflm formation and mutations on motility

为检测GadBCD系统对运动性的影响,野生株TX01和敲除株ΔgadP穿刺接种到软琼脂运动性平板内,培养18 h 后发现,敲除株ΔgadP 的游动圈直径显著小于野生株TX01(图6b)。表明GadBCD系统的缺失削弱了杀鱼爱德华氏菌的运动性。

2.8 GadBCD系统对细菌致病性的影响

既然GadBCD系统与细菌的抗酸性、生物膜形成和运动性等性能相关,推测其很可能参与细菌的致病性。为明确GadBCD系统是否在杀鱼爱德华氏菌致病过程中起作用,我们将对数期的野生株TX01和敲除株ΔgadP分别感染 FG 细胞1 h 和2 h,然后检测黏附到细胞表面和侵入到细胞内的细菌。结果表明,在2个检测时间点,均发现敲除株ΔgadP的数量显著低于野生株TX01(图7a)。这表明GadBCD系统的缺失减弱了杀鱼爱德华氏菌的对宿主非吞噬细胞的黏附和侵入。

图7  GadBCD系统对杀鱼爱德华氏菌致病性影响

Fig.7  Effects of GadBCD on pathogenicity of Edwardsiella piscicida

(a)对FG细胞的黏附和侵袭;(b) 巨噬细胞RAW264.7中的存活和复制;(c) 血清压力下的存活率。

(a)The adhesion and invasion to FG cells;(b) Survival and replication in macrophage cell RAW264.7;(c)survival rate under serum pressure.

为检测GadBCD系统对细菌在宿主吞噬细胞内存活的影响,野生株和敲除株感染小鼠巨噬细胞 RAW264.7,杀灭胞外细菌后检测胞内存活的细菌数。结果表明,在4个检测感染时间点,巨噬细胞内存活的ΔgadP数量均明显少于野生株TX01(图7b)。这表明GadBCD系统的缺失大大减弱了杀鱼爱德华氏菌在吞噬细胞中的繁殖和存活能力。

杀鱼爱德华氏菌具有强的抗宿主血清杀菌能力,可通过血液引发系统性感染。为探究GadBCD系统与细菌抗宿主血清杀菌能力的关系,野生株和敲除株与罗非鱼血清孵育1 h后检测存活细菌的数量。结果表明,敲除株ΔgadP在宿主血清中的存活率仅为40%,显著低于野生株80%的存活率(图7c)。这表明GadBCD系统的缺失降低了杀鱼爱德华氏菌对在宿主血清中的存活能力。

3 讨论

对于许多动物病原菌来说,对中强酸和强酸的耐受能力决定其能否在宿主胃酸和吞噬细胞等酸性环境中存活,因而耐酸性是病原菌致病的一个重要性能。谷氨酸脱羧酶系统往往是众多致病菌最重要的抗强酸系统。大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶系统,由谷氨酸脱羧酶GadA和GadB以及转运蛋白GadC组成,且GadB和GadC处在1个操纵子上;研

32发现gadAgadBgadC 的缺失都大大降低细菌在强酸下的存活率,这表明该系统是大肠杆菌重要的抗强酸系统。BERGHOLZ33发现虽然gadAgadB序列同源性高达97%,但两者在染色体上间隔较远,以不同的机制发挥抗强酸作用。与大肠杆菌不同的是,单增李斯特菌具有3个谷氨酸脱羧酶系统,分别是在弱酸条件下发挥抗酸应激作用的GadD1/GadT1和在强酸性条件下发挥作用的GadT2/GadD2和GadT3/GadD334。弗氏志贺菌的谷氨酸脱羧酶系统由谷氨酸脱羧酶GadA和GadB以及转运蛋白GadC组成,研究证明弗氏志贺菌gadB突变体失去了抗强酸杀灭能力,通过与野生型gadB基因互补可以恢复抗酸能35

杀鱼爱德华氏菌是水产重要致病菌,其致病机制的研究近年来取得积极进展,一些重要的毒力因子和新型的毒力因子相继被鉴定和阐

36,但该菌的抗强酸系统还未知。经序列与结构分析,我们发现杀鱼爱德华氏菌的谷氨酸脱羧酶系统由GadB、GadC、GadD、GadC2和GadC3共5个蛋白组成,命名为GadBCD系统。该系统5个蛋白的编码基因组成1个操纵子,不仅有谷氨酸脱羧酶(GadB),还包括了谷氨酰胺酶(GadD);其中谷氨酰胺酶可以消耗谷氨酰胺产生NH3和谷氨酸,NH3H+反应生成NH4+达到消耗H+的目的,谷氨酸脱羧过程又进一步消耗H+。因此,GadBCD系统可同时利用GadB和GadD快速高效地消耗H+。与其他细菌相比,杀鱼爱德华氏菌谷氨酸脱羧酶系统组成具有独特性。

杀鱼爱德华氏菌GadBCD系统的独特性产生了3种效应:(1)具有抗中强酸作用。本研究结果表明,GadBCD系统的敲除致使杀鱼爱德华氏菌在中强酸(pH=4.2)条件下无法正常生长,而野生株可正常生长。(2)具有抗强酸作用。GadBCD系统缺失导致杀鱼爱德华氏菌在强酸刺激2 h后的存活率从8.3%锐降至0.5%。(3)比其他细菌如大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶系统具有更高效的抗酸功能。本研究结果表明杀鱼爱德华氏菌在pH = 2.5酸性环境下刺激2 h的存活率(8.3%)大大高于同等条件下大肠杆菌的存活率(0.2%

37;且外源添加Glu后,杀鱼爱德华氏菌增加至78%,显著高于大肠杆菌的存活率(30%37。基于上述结果,我们认为杀鱼爱德华氏菌GadBCD系统是1个新型的谷氨酸脱羧酶系统,既具有组成上的独特性,又具有抗酸性能的高效性。

细菌的耐酸性与生物膜形成密切相关。生物膜是一种嵌入在胞外聚合物的自生成基质中的微生物聚集集体,微生物通过生物膜黏附或附着在材料表

38。据报道,生物膜可增强细菌对酸胁迫的耐受39,例如,生物膜的形成显著增加了临床链球菌戈登链球菌(Streptococcus gordonii)和口腔链球菌(S. oralis)的耐酸40。在本研究中,杀鱼爱德华氏菌抗酸系统GadBCD反而与生物膜形成负相关,其中的机制有待于今后进一步探究。细菌生物膜通常与运动性密切相关,例如,SHI 41发现生物膜形成因子 HutZ 参与了 杀鱼爱德华氏菌的运动调节,CHEN 42发现 ToxR 蛋白是调节副溶血弧菌生物膜形成和运动所必需的蛋白。然而,细菌耐酸性与运动性的关系研究不多。我们之前的研究表明,杀鱼爱德华氏菌抗弱酸系统CadBA可促进细菌的运动25,但未见有谷氨酸脱羧酶系统与运动性关系的研究报道。本研究中我们发现谷氨酸脱羧酶系统 GadBCD参与了杀鱼爱德华氏菌运动性。

细菌的生物膜形成和运动性等生理性能与细菌的致病性密切相关,且耐酸性也是一些肠道病原菌致病的重要因素,因此我们分析了GadBCD系统与细菌致病性的关系。发现GadBCD系统的缺失减弱了杀鱼爱德华氏菌的对宿主非吞噬细胞的黏附和侵入、减弱了细菌在宿主吞噬细胞的繁殖和存活能力、降低了细菌抵御宿主血清杀伤的能力,这充分说明GadBCD系统与杀鱼爱德华氏菌毒力密切相关。相似地,大肠杆菌谷氨酸脱羧酶系统也有细菌致病性,SHIN

43发现大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的激活因子GadX可以调控毒力基因的表达。在单增李斯特菌中同样发现谷氨酸脱羧酶系统在毒力中起着重要作用,缺乏谷氨酸脱羧酶系统的敲除株表现出耐酸性降低,并且在口服接种后引起感染的能力受到显著下44

综上所述,本研究首次在杀鱼爱德华氏菌中鉴定了1个新型的谷氨酸脱羧酶系统GadBCD。GadBCD系统包括了谷氨酸脱羧酶、谷氨酰胺酶以及3个转运体,5个蛋白编码基因组成1个操纵子。该系统不仅是杀鱼爱德华氏菌耐中强酸和强酸所必需的,而且还与细菌生物膜形成和运动性相关,同时也是细菌感染宿主细胞的重要参与者,因而是杀鱼爱德华氏菌1个重要的毒力因子。本研究为了解杀鱼爱德华氏菌的耐酸机制与致病机制提供了新的思路。

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